劉本君，張久麗，高 利，王洪偉，魏成威

（1.黑龍江科技職業(yè)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 雙城 150111；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

奶牛乳腺炎是指奶牛的乳腺組織內(nèi)發(fā)生的不同程度的炎癥，并伴有乳汁物理、化學(xué)及微生物學(xué)變化。它一般是由病原微生物感染、飼養(yǎng)管理、環(huán)境、遺傳等因素綜合作用引起的。乳腺炎的發(fā)生不僅使發(fā)情配種的時間延長，降低了奶牛的生產(chǎn)性能，而且還嚴(yán)重地影響了牛奶制品的品質(zhì)，危及人類健康。

細胞因子是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有調(diào)節(jié)多種細胞的生理功能。它們是細胞間相互溝通的橋梁之一，通常以網(wǎng)絡(luò)的形式存在，并且相互影響，相互誘生，在機體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的過程中具有十分重要的作用。白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）是由Grey等人于1972年發(fā)現(xiàn)的一種能激活多種免疫細胞和炎癥細胞的前炎性細胞因子。IL-1主要由單核-巨噬細胞和嗜中性粒細胞等產(chǎn)生的。根據(jù)其分子的結(jié)構(gòu)和等電點不同，IL-1分為IL-1α和IL-1β，IL-1β具有廣泛的生物活性，是體內(nèi)作用最強的炎癥介質(zhì)之一。研究表明，IL-1β能夠促進血管內(nèi)皮-白細胞黏附分子的表達，趨化嗜中性粒細胞等炎性細胞進入機體病變部位，從而引起一系列炎癥反應(yīng)，其細胞因子mRNA的表達與炎癥程度呈正相關(guān)，可作為臨床上判斷疾病嚴(yán)重程度和療效的指標(biāo)［1］。白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）是一種多功能的細胞因子，是由激活的巨噬細胞、淋巴細胞及上皮細胞等產(chǎn)生和分泌的一種糖蛋白。體內(nèi)的多種細胞既能產(chǎn)生和釋放IL-6，受到刺激后也能表達IL-6基因，因此說IL-6在免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。IL-6能促進嗜中性粒細胞的活化和聚集，血清中IL-6水平可反應(yīng)組織損傷程度［2］。IL-6表達失調(diào)與一些疾病的發(fā)生密切相關(guān)，在自身免疫性疾病、多發(fā)性骨髓瘤、骨質(zhì)疏松癥的病人中都出現(xiàn)IL-6的失控性表達［3］。

1 材料與方法

1.1 試驗動物分組 利用乳汁體細胞計數(shù)儀檢測法對阿城區(qū)某奶牛示范基地的40頭試驗?zāi)膛＿M行分組，要求全部奶牛年齡和泌乳期相近，分為C組（SCC＜50萬個／mL）、Ⅰ組（50萬個／mL＜SCC＜150萬個／mL）、Ⅱ組（150萬個／mL＜SCC＜500萬個／mL）、Ⅲ組（SCC＞500萬個／mL）。

1.2 樣品采集

1.2.1 血樣的采集 頸靜脈采集C組、Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組各10頭奶牛的血液，采樣前消毒取血部位，對每頭牛約取15mL的血液，將采集的血樣室溫下靜止。

1.2.2 乳樣的采集 采集C組、Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組各10頭奶牛的乳汁，采樣前對乳區(qū)進行清洗，然后用70%酒精消毒乳區(qū)，棄掉頭2把乳汁，進行全天采樣，從早上6點開始，每間隔5h進行取樣，取樣3次，每次20mL，最后混入無菌奶瓶中。將采集的乳樣放到有冰塊的泡沫箱中，將乳樣帶回東北農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實驗室檢測。

1.3 樣品處理與測定

1.3.1 血樣的處理及測定 頸靜脈采集血液，在室溫下，一般要求不超過20℃，自然凝固1～2h，冰浴30min，然后3000r／min離心10min，分離血清，4℃保存，待測。如檢測時間較長，要將樣品置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。樣品采用北京華英生物技術(shù)研究所IL-1β、IL-6放免試劑盒進行測定。

1.3.2 乳樣的處理及測定 將乳樣3000r／min離心5min，除去上層乳脂，然后于16000r／min高速離心機中離心10min，去除沉淀，保留上清，4℃保存，待測。如檢測時間較長，要將樣品置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。樣品采用北京華英生物技術(shù)研究所IL-1β、IL-6放免試劑盒進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析 利用軟件SPSS 13.0統(tǒng)計分析進行分析處理，數(shù)據(jù)用SD表示。

2 結(jié)果

表1 血清各組中IL-1β、IL-6含量

圖1 血清各組中IL-1β含量

圖2 血清各組中IL-6含量

表2 乳清各組中IL-1β、IL-6含量

圖3 乳清各組中IL-1β含量

圖4 乳清各組中IL-6含量

3 討論

奶牛的乳腺是機體內(nèi)一個復(fù)雜生物反應(yīng)器，在乳腺內(nèi)部，眾多的保護因子包括細胞因子、抗體、激素、酶和神經(jīng)遞質(zhì)等一起構(gòu)建了多條錯綜復(fù)雜的信號通路，這些因子之間的動態(tài)平衡是維持乳腺健康的基本條件。當(dāng)奶牛乳腺發(fā)生炎癥時，機體抵抗力下降，體內(nèi)細胞因子及其受體的表達就會發(fā)生異常［4］。因此，重視對細胞因子及其受體的檢測，對研究細胞因子在乳腺炎癥反應(yīng)中的平衡十分必要。

IL-1β作為炎癥和免疫源性的細胞因子，參與體內(nèi)多種炎癥反應(yīng)。在正常情況下，血液中IL-1β的含量很低，但是在理化和生物等因素的誘導(dǎo)下，單核-巨噬細胞、淋巴細胞等均能表達及釋放IL-1β，并在體內(nèi)發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。本試驗結(jié)果顯示，血清和乳清中IL-1β的含量與C組比較，Ⅰ組IL-1β的含量無顯著變化（P＞0.05），Ⅱ組、Ⅲ組IL-1β的含量極顯著升高（P＜0.01），這與 Wenz等報道的IL-1β隨奶牛乳腺炎程度的增加而增加相一致［5］。IL-1β是炎癥反應(yīng)早期最具影響的介質(zhì)之一［6］，因此能較早而敏感的反映出組織損傷的程度。當(dāng)奶牛發(fā)生乳腺炎癥后，主要表現(xiàn)為炎區(qū)周圍嗜中性粒細胞的浸潤并釋放細胞因子，同時微循環(huán)出現(xiàn)損傷。隨著炎癥的加劇，IL-1β的產(chǎn)生和釋放也逐漸增加，當(dāng)出現(xiàn)明顯的臨床癥狀時含量有所減少，但仍然高于對照組。主要原因可能是因為IL-1β是急性期反應(yīng)的主要誘導(dǎo)物，待炎癥發(fā)生后在體內(nèi)的含量也逐漸降低。另外，到了炎癥后期TNF-α的大量分泌對IL-1β分泌也起到一定的抑制作用。

IL-6是炎癥細胞因子網(wǎng)絡(luò)中的重要組成成分，與體內(nèi)感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。有研究表明，奶牛乳腺炎的發(fā)生和臨床癥狀與細胞因子有關(guān)，乳腺炎急性期反應(yīng)就是由IL-6和TNF-α等細胞因子激發(fā)和介導(dǎo)。本試驗結(jié)果顯示，血清中IL-6的含量與C組比較，Ⅰ組IL-6的含量無顯著變化（P＞0.05），Ⅱ組、Ⅲ組IL-6的含量極顯著升高（P＜0.01）；乳清中IL-6的含量與C組比較，Ⅰ組IL-6的含量顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），Ⅱ組、Ⅲ組IL-6的含量極顯著升高（P＜0.01）。IL-6是一種遲發(fā)性細胞因子，能催化和放大炎性反應(yīng)，隨著炎癥的加劇體內(nèi)IL-6含量也增加，主要是奶牛乳腺發(fā)生炎癥后，炎癥刺激乳房局部的巨噬細胞和上皮細胞，使乳汁中IL-6含量增加。與此同時，炎癥激活機體免疫功能，血液中的淋巴細胞被活化后IL-6等炎性反應(yīng)因子分泌合成功能增強，于是血液中IL-6含量也增加。另外體內(nèi)IL-1和TNF-α的增加也可促進IL-6的產(chǎn)生［7］。Hagiwara K 等［8］研究表明，患急性乳腺炎奶牛乳清與血清中IL-6的含量高低，與乳腺炎發(fā)病程度及恢復(fù)情況有著線性關(guān)系，可以成為治療乳腺炎效果的指標(biāo)。

不同程度乳腺炎乳汁中IL-6的活性隨著乳腺炎的嚴(yán)重程度的增加而呈遞增趨勢，均高于C組，但Ⅰ組血清中的IL-6含量與對照組無顯著變化，不具備乳腺炎的評價。不同程度乳腺炎血液中和乳汁中IL-1β的活性均隨著乳腺炎的嚴(yán)重程度的增加而呈遞增趨勢，表現(xiàn)為先升高后降低，不具備評價乳腺炎的價值。由此可知，奶牛血清和乳清中的IL-1β、IL-6的含量與奶牛乳腺是否發(fā)生炎癥反應(yīng)以及奶牛機體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，并且乳汁中的IL-6可作為奶牛乳腺炎診斷指標(biāo)。

［1］Christman J W，Sadikot R T，Blackwell T S.The Role of Nuclear Factor-Kappa B in Pulmonary Diseases［J］.Chest，2000，117（5）：1482-1487.

［2］楊沛，陳偉，文愛清.聯(lián)合檢測血清Lipase、CRP和IL-6在急性胰腺炎診斷和預(yù)后判斷中的價值［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2002，31（11）：1048.

［3］陳小奇.白細胞介素-6與2型糖尿病發(fā)生的研究進展［J］.國外醫(yī)學(xué)：分子生物學(xué)分冊，2002，24（2）：108-110.

［4］Riollet C，Rainard P，Poutrela B.Cell subpopulations and cytokine expression in cow milk in response to chronic Staphylococcus aureus infection［J］.J Dairy Sci，2001，84（5）：1077-1084.

［5］Wenz J R，F(xiàn)ox L K，Muller F J，et al.Factors associated with concentrations of select cytokine and acute phase proteins in dairy cows with naturally occurring clinical mastitis［J］.J Dairy Sci，2010，93：2458-2470.

［6］Rezamand P，McGuire M A.Effects of trans fatty acids on markers of inflammation in bovine mammary epithelial cells［J］.J Dairy Sci，2011，94：316-320.

［7］吳朝棟.內(nèi)毒素誘生的細胞因子及其作用研究進展［J］.國外醫(yī)學(xué)：免疫學(xué)分冊，1995，3（1）：11-14.

［8］Hagiwara K，Yamanaka H，Hisaeda K，et al.Concentration of IL-6in serum and whey from healthy and mastitic cows［J］.Vet Res Commun，2001，25（2）：99-108.