白靖，向柏，申磊，何朝星，張貴琴，曹德英（河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，石家莊市050017）

維生素是維持人體健康所必需的營養(yǎng)元素[1]，有利于促進(jìn)和平衡體內(nèi)組織的新陳代謝，被廣泛用于臨床治療、輔助治療及日常營養(yǎng)、保健。目前，復(fù)方維生素類制劑占據(jù)了相當(dāng)大的市場，因此關(guān)于維生素測定方法的研究越來越值得關(guān)注。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[2]的引入，將色譜的分離能力與質(zhì)譜的定性功能相結(jié)合，提高了微量元素的檢測靈敏度和精準(zhǔn)度，然而此方法高成本的缺點(diǎn)限制了其普及應(yīng)用。因此，如何運(yùn)用常規(guī)的維生素測定方法，無論是紫外分光光度法[3]、熒光分光光度法[4]，還是高效液相色譜（HPLC）法[5，6]，簡便、準(zhǔn)確、高效地測定多種維生素，已成為復(fù)方維生素制劑質(zhì)量控制研究的重要手段。

復(fù)合維生素口服液為河北醫(yī)科大學(xué)藥劑教研室自制保健產(chǎn)品，旨在將脂溶性維生素與水溶性維生素相結(jié)合，其主要成分為維生素A、維生素D3、維生素E、右泛醇、維生素B1、維生素B2磷酸酯鈉、煙酰胺、維生素B6等，可為人體提供全方位的營養(yǎng)支持，用于營養(yǎng)不良及臨床輔助治療。目前關(guān)于維生素B1、維生素B2磷酸酯鈉、煙酰胺、維生素B64種水溶性維生素的含量測定方法，大多采用HPLC法，應(yīng)用流動(dòng)相梯度洗脫方式[7]，樣品處理煩瑣，測量時(shí)間較長，且往往僅限于分析水溶性維生素組成的復(fù)方制劑。本研究在摸索復(fù)合維生素口服液中多組分維生素含量測定方法時(shí)，建立了方便的等度反相HPLC法同時(shí)測定制劑中維生素B1、維生素B2磷酸酯鈉、煙酰胺和維生素B6的含量，實(shí)現(xiàn)了在脂溶性維生素并存的情況下分析目標(biāo)水溶性維生素，而且每個(gè)樣品進(jìn)樣前只需用水稀釋，分析時(shí)間小于15 min。該法簡便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，大大縮短了測量時(shí)間，有利于生產(chǎn)過程中該類產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Lab Alliance Model 500 HPLC儀（美國Lab Alliance公司）；BP211D型電子分析天平（德國Satorius公司）；復(fù)合維生素口服液（自制，批號(hào)：20100301、20100302、20100303，規(guī)格：每支10 mL，含維生素B1100 mg、維生素B2磷酸酯鈉70 mg、煙酰胺350 mg和維生素B630 mg）；己烷磺酸鈉（天津傲然精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20071116，純度：≥99.0%）；煙酰胺、維生素B6、維生素B1和維生素B2磷酸酯鈉（核黃素磷酸鈉）標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為：100115-200302、100116-200502、100390-200502、100283-200501，純度：均大于99.0%）；甲醇為色譜純，冰醋酸為分析純；水為二次純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：己烷磺酸鈉溶液（1 g→690 mL水）-甲醇-冰醋酸（690∶303∶7，V/V/V）；流速：1 mL·min－1；檢測波長：280 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密稱取煙酰胺875 mg、維生素B675 mg、維生素B1250 mg和維生素B2磷酸酯鈉175 mg，同置于250 mL容量瓶中，加水100 mL使溶解，再用水稀釋至刻度，搖勻。精密量取10 mL，置于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2.2 供試品溶液。將復(fù)合維生素口服液搖勻，精密量取2.5 mL，置于250 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液各20 μL注入色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，記錄色譜，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

由圖1可見，在上述色譜條件下，含有脂溶性維生素的復(fù)合維生素口服液中的煙酰胺、維生素B6、維生素B1和維生素B2磷酸酯鈉能得到很好的分離。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品煙酰胺875 mg、維生素B675 mg、維生素B1250 mg和維生素B2磷酸酯鈉175 mg置于同一100 mL容量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻。吸取上述溶液0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取上述溶液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，濃度（c，μg·mL－1）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，相關(guān)結(jié)果見表1。

表1 各組分線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 1 Results of linear ranges for 4 kinds of vitamins

表1結(jié)果表明，各組分在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，煙酰胺、維生素B6、維生素B1和維生素B2磷酸酯鈉峰面積值的RSD分別為0.5%、0.6%、0.6%和0.9%（n＝6），表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液（冷處貯藏），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果，煙酰胺、維生素B6、維生素B1和維生素B2磷酸酯鈉峰面積值的RSD分別為0.7%、0.6%、1.2%、1.9%（n＝5），表明溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取本品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果，煙酰胺、維生素B6、維生素B1和維生素B2磷酸酯鈉峰面積值的RSD分別為0.7%、0.8%、0.7%、1.3%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

分別按處方量的80%、100%、120%精密稱取煙酰胺，按處方比例稱取其他主藥及輔料制備成低、中、高濃度（280、350、420 μg·mL－1）的樣品溶液各3份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算回收率；同法測定維生素B6、維生素B1和維生素B2磷酸酯鈉的回收率。結(jié)果煙酰胺、維生素B6、維生素B1和維生素B2磷酸酯鈉的平均回收率分別為101.3%（RSD＝1.7%，n＝9）、99.5%（RSD＝1.5%，n＝9）、100.0%（RSD＝1.9%，n＝9）和98.4%（RSD＝2.0%，n＝9）。

2.9 樣品含量測定

取3批復(fù)合維生素口服液，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。取標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算樣品濃度，結(jié)果詳見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2Results of content determination in samples（n＝3）

3 討論

本試驗(yàn)在流動(dòng)相組成考察時(shí)，發(fā)現(xiàn)在甲醇的基礎(chǔ)上加入少量冰醋酸，指標(biāo)成分峰形和分離效果有明顯改善；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，離子對試劑己烷磺酸鈉的加入，能有效改善主峰的分離度，且流動(dòng)相中己烷磺酸鈉溶液與甲醇的比例對主峰分離效果影響較大，最終確定己烷磺酸鈉溶液與甲醇的比例為690∶303（V/V）。本文使用己烷磺酸鈉作離子對試劑，用簡單的等度洗脫方式即可實(shí)現(xiàn)對4種水溶性維生素的分離，而且脂溶性維生素組分及輔料對其測定無干擾；整個(gè)樣品的分析時(shí)間僅為15 min，大大提高了分析效率。同時(shí)，試驗(yàn)證明，樣品進(jìn)樣前只需用水稀釋，即可滿足指標(biāo)成分的檢測，既降低了成本，又避免了操作上的煩瑣，有利于實(shí)際生產(chǎn)過程中大量產(chǎn)品的分析測定。

考慮到維生素對氧、光、熱、金屬離子敏感[8]，建議本品密封、避光、冷處保存，且供試品溶液制備后盡快分析測定。

本試驗(yàn)建立的HPLC法能夠同時(shí)測定煙酰胺、維生素B6、維生素B1和維生素B2磷酸酯鈉4種維生素成分的含量，且方法簡便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為含有上述維生素類成分的多維復(fù)方制劑及保健產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了參考。

[1] Asplund K，Normark M，Pettersson V.Nutritional assessment of psychogeriatric patients[J].Age Ageing，1981，10（2）：87.

[2] Mittermayr R，Kalman A，Trisconi MJ，et al.Determination of vitamin B5in a range of fortified food products by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry with electrospray ionisation[J].J Chromatogr A，2004，1 032（1-2）：1.

[3] Aaya SP，Mahajan M，Jain P.Spectrophotometric determination of vitamin C with iron（Ⅱ）-4-（2-pyridylazo）resorcinol complex[J].Anal Chim Acta，2001，427（2）：245.

[4] García L，Blázquez S，San Andrés MP ，et al.Determination of thiamine，riboflavin and pyridoxine in pharmaceuticals by synchronous fluorescence spectrometry in organized media[J].Anal Chim Acta，2001，434（2）：193.

[5]Markopoulou CK，Kagkadis KA，Koundourellis JE.An optimized method for the simultaneous determination of vitamins B1，B6，B12，in multivitamin tablets by high performance liquid chromatography[J].J Pharm Biomed Anal，2002，30（4）：1 403.

[6] 陳桂紅，黃清松.HPLC法測定多維鐵口服溶液中維生素B1、維生素B2的含量[J].中國藥房，2008，19（10）：776.

[7] 李祥勝，闞家義.復(fù)合維生素B注射液中4種維生素含量測定[J].安徽醫(yī)藥，2009，13（7）：755.

[8] Tav?ar-Kalcher G，Vengu?t A.Stability of vitamins in premixes[J].Anim Feed Sci Technol，2007，132（1）：148.