郭 冉，劉潔婷，吳 丹，徐秋玲，初彥輝※

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院生理教研室，黑龍江牡丹江157011;2.黑龍江省抗纖維化生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江牡丹江157011)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)是目前已知的與瘢痕形成關(guān)系最為密切的細(xì)胞因子，研究最為廣泛［1，2］。它既可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成又可以抑制其降解。在創(chuàng)傷中TGF-β1的表達(dá)增加，同時(shí)還能刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性TGF-β1，甚至加入外源性的TGF-β1可以增加創(chuàng)傷中膠原纖維蛋白和炎性細(xì)胞的數(shù)量［3］。陳永平等［4］曾提出將TGF-β1構(gòu)建為疫苗，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，中和體內(nèi)產(chǎn)生的過量的 TGF-β1。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，抗TGF-β1抗體具有中和 TGF-β1活性的作用［5］，抗TGF-β1抗體能明顯抑制成纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，能抑制成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成［6］。

1 材料與方法

1.1 材料 人重組TGF-β1蛋白由黑龍江省抗纖維化生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;雄性新西蘭白兔2只，4.5～5 個(gè)月齡，體質(zhì)量(2.2 ±0.2)kg。購(gòu)自黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心?？刹鹦睹笜?biāo)板為Corning公司生產(chǎn)。弗氏不完全佐劑(Freunds adjuvant，incomplete)、弗氏完全佐劑 (Freunds adjuvant，complete)購(gòu)自 Sigma公司。3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽購(gòu)自AMRESCO公司。UPS-蛋白質(zhì)銀染試劑盒由溫州安得森生物科技有限公司惠贈(zèng);辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原乳化 用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS，pH=7.4)將 TGF-β1蛋白稀釋至1 μg/L，按體積比1∶11加入弗氏佐劑，混合至乳狀，待成為乳白色黏稠的油包水乳劑時(shí)，將佐劑抗原滴入冰水表面，滴入后10 min應(yīng)保持完整而不分散時(shí)，即為合格［7］。

1.2.2 免疫動(dòng)物 動(dòng)物免疫前，由耳緣靜脈取血5 mL，分離血清，置－20℃保存，作為陰性對(duì)照。取充分乳化后蛋白，皮下多點(diǎn)注射新西蘭白兔，每只用量為0.5 mg;14 d后用弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫1次。共加強(qiáng)免疫3次，后兩次加強(qiáng)免疫直接靜脈注射不含佐劑的抗原0.5 mg。第21天開始耳緣靜脈取血檢測(cè)效價(jià)，末次免疫7 d后頸總動(dòng)脈采血收集抗血清，分裝后－80℃保存。

1.2.3 純化多克隆抗體 采用飽和硫酸銨鹽析沉淀法純化抗體［8］。①取兔血清10 mL與等體積生理鹽水混合后，于攪拌下緩慢滴加飽和硫酸銨20 mL，于4℃緩慢攪拌3～4 h，使蛋白充分沉淀。②4℃離心，3000 r/min，30 min，棄上清，用 6 mL 生理鹽水溶解沉淀，緩慢滴加4 mL飽和硫酸銨，4℃緩慢攪拌1 h。重復(fù)②步。③4℃離心，用6.7 mL生理鹽水溶解沉淀，滴加3.3 mL飽和硫酸銨，4℃緩慢攪拌1 h。重復(fù)③步。④4℃離心，用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH=7.4)2 mL溶解沉淀，磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L)透析，更換3次磷酸鹽緩沖液，4℃緩慢搖動(dòng)過夜，得到抗血清，分裝后置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 檢測(cè)多克隆抗體的效價(jià) 將TGF-β1重組蛋白用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH=9.6)稀釋成0.025 μg/L，每孔100 μL 體積包被反應(yīng)板，4℃過夜;37℃封閉2 h，再4℃過夜;將純化后多抗兔血清用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L)倍比稀釋(1∶1200～1∶125 600)，同時(shí)取免疫前血清1∶1500稀釋，作為陰性對(duì)照。每組3個(gè)復(fù)孔。每孔100 μL體積加入反應(yīng)孔中，37℃，1 h;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔酶標(biāo)抗體稀釋液 100 μL(1∶14 000)，37℃，1 h;加入3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽工作液 100 μL，于37℃避光顯色15～30 min;加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng);酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔OD值。P/N值=(A樣品-A空白對(duì)照)/(A陰性樣品-A空白對(duì)照)，P/N值≥2.1判為陽性，反之則為陰性。陽性反應(yīng)的最大稀釋度即為待測(cè)樣品的效價(jià)［9］。

1.2.5 十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)抗體 取純化后的抗血清，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)檢測(cè)，確定純化后抗血清中免疫球蛋白的含量以及純化的效果。

1.2.6 Western blot檢測(cè)抗體 取人重組TGF-β1蛋白10 μL，以純化后的兔抗人TGF-β1多克隆抗體作為一抗(1∶110 000)，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔酶標(biāo)抗體作為二抗，進(jìn)行Western blot檢測(cè)抗體的特異性。

2 結(jié)果

2.1 多克隆抗體效價(jià)測(cè)定 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)得純化后抗體效價(jià)為1∶112 800。

2.2 SDS-PAGE檢測(cè)抗體 純化后的抗血清經(jīng)還原型SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果如圖1，主要蛋白條帶在約50×103位置，符合兔免疫球蛋白基本特征，另外，在20×103左右出現(xiàn)較彌散的條帶，為免疫球蛋白輕鏈分子。

圖1 SDS-PAGE分析多克隆抗體

圖2 免疫印跡分析多克隆抗體

2.3 Western blot檢測(cè)抗體 以純化后的多克隆抗體作為一抗，與人重組TGF-β1蛋白進(jìn)行Western blot免疫印跡分析，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，多克隆抗血清與TGF-β1蛋白分子量位置發(fā)生反應(yīng)，說明制備的多克隆抗體能與目的蛋白特異性結(jié)合。

3 討論

抗 TGF-β1抗體，作為 TGF-β1有效的拮抗劑，能競(jìng)爭(zhēng)性抑制TGF-β1與其受體結(jié)合，阻斷其生物活性，從而避免或者減輕TGF-β1對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的不利影響，并對(duì)各種器官的纖維化治療起到一定的作用。一些研究TGF-β與瘢痕形成的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用抗TGF-β抗體可能會(huì)減輕瘢痕。Shah等［10］的研究顯示，在成年大鼠皮下局部注射TGF-β1和TGF-β2抗體可降低TGF-β的水平，減少單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的數(shù)量，減少Ⅰ型和Ⅱ型膠原的沉積，結(jié)果瘢痕顯著減少。經(jīng)抗體處理后的動(dòng)物模型傷口，其膠原的沉積、巨噬細(xì)胞和血管的增生等均比對(duì)照組減少，其張力和皮膚結(jié)構(gòu)則與對(duì)照組一致。在創(chuàng)傷早期應(yīng)用抗TGF-β 抗體對(duì)降低 TGF-β 水平，避免 TGF-βmRNA自我誘導(dǎo)，限制巨噬細(xì)胞增生和TGF-β的釋放具有重要作用。

目前，對(duì) TGF-β抗體的研究多為體外實(shí)驗(yàn)，且TGF-β抗體成品比較昂貴，使其應(yīng)用受到限制。本實(shí)驗(yàn)以TGF-β1蛋白作為抗原，在動(dòng)物體內(nèi)制備多克隆抗血清。經(jīng)飽和硫酸銨鹽析法純化后，間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)多克隆抗體效價(jià)達(dá)1∶110 000以上。SDS-PAGE分析及Western blot檢測(cè)，本研究所獲得的兔抗人TGF-β1多克隆抗體純度較高，能與TGF-β1目的蛋白特異性結(jié)合。為進(jìn)一步研究與TGF-β1密切相關(guān)的疾病，特別是抗纖維化的研究提供了有利條件，奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

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