李茂星，張 超，烏 蘭，尉麗力，邱建國，張泉龍，賈正平(.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科，全軍高原環(huán)境損傷防治重點實驗室，甘肅蘭州 70050;2.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州 70000;.西北民族大學(xué)化工學(xué)院，甘肅蘭州 7000)

螃蟹甲為唇形科糙蘇屬多年生草本植物螃蟹(Phlomis younghusbandii Mukerjee)的干燥塊根，藏語稱“露木爾”，為藏醫(yī)習(xí)用藥材，廣泛分布于青海、西藏海拔2 700～4 800 m的地區(qū)［1］。傳統(tǒng)中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥理論認(rèn)為螃蟹甲具有強(qiáng)筋壯骨、祛風(fēng)活絡(luò)、清熱消腫、止咳祛痰的功效，廣泛用于治療咳嗽、感冒、肺炎、支氣管炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、瘡疥腫毒等疾病。現(xiàn)代藥理研究其鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘效果顯著，臨床應(yīng)用也非常廣泛。作者前期對螃蟹甲的化學(xué)成分研究表明螃蟹甲中大量含有環(huán)烯醚萜苷和苯乙醇苷類成分，有關(guān)螃蟹甲中環(huán)烯醚萜苷類化合物的含量測定目前已有文獻(xiàn)報道［2，3］，而苯乙醇苷類化合物的含量測定未見報道。藥理學(xué)研究表明，苯乙醇苷類化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、增強(qiáng)記憶、保肝和強(qiáng)心等作用［4，5］，可能為螃蟹甲中的活性成分。為了更有效地控制螃蟹甲藥材及其制劑的質(zhì)量，本測定首次采用HPLC法對不同產(chǎn)地的螃蟹甲藥材和1個螃蟹甲制劑中3個苯乙醇苷類成分的含量進(jìn)行測定和比較，希望可以為進(jìn)一步完善該藥材的品質(zhì)評價及質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀，包括600型二元梯度泵、996型二極管陣列紫外檢器(美國 Waters公司)，BP210S電子分析天平(Sartorius公司)，SK7200H超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司);甲醇為色譜純，水為滅菌注射用水，其余試劑均為分析純;對照品毛蕊花糖苷、alyssonoside、異毛蕊花糖苷均為本實驗室自制［從螃蟹甲藥材中分離得到，經(jīng)光譜學(xué)和波譜學(xué)分析鑒定其結(jié)構(gòu)(圖1)，經(jīng)HPLC面積歸一化法計算，純度均在98%以上］。螃蟹甲對照藥材由中國藥品生物制品檢定所提供(批號為121407-200401)。螃蟹甲藥材(3份，分別收購于西藏林芝、拉薩、四川成都，經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院馬志剛教授鑒定為螃蟹甲Phlomis younghusbandii Mukerjee)。螃蟹甲制劑七味螃蟹甲丸(0.25 g/粒，青海琦鷹生物制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20054325，批號20091203)。

圖1 螃蟹甲中的3個苯乙醇苷類化合物的結(jié)構(gòu)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為 Symmetry C18色譜柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm);洗脫流動相為甲醇-水(36∶64)，冰醋酸調(diào) pH 至4.5;流速1.0 ml/min;檢測波長330 nm;柱溫20℃;進(jìn)樣量10 μl。

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取干燥至恒重的毛蕊花糖苷、alyssonoside、異毛蕊花糖苷各25 mg置25 ml量瓶中，加70%的甲醇至刻度。即得濃度為1 mg/ml的對照品儲備溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取螃蟹甲藥材粉末(過四號篩)1 g，精密稱定;取七味螃蟹甲丸8粒，研細(xì)，分別置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 ml，稱定重量，超聲處理45 min，冷卻，再稱定重量，加70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過，取濾液，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

2.4.1 理論塔板數(shù)和分離度 在“2.1”項下的色譜條件下，取混合對照品溶液(毛蕊花糖苷、alyssonoside、異毛蕊花糖苷按濃度2∶1∶1混合)，供試品溶液各10 μl，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖2。在圖2中，毛蕊花糖苷、alyssonoside、異毛蕊花糖苷的保留時間分別為 10.0、14.9、17.4 min，與相鄰峰的分離度均大于1.5，理論踏板數(shù)均大于2 000。

圖2 螃蟹甲藥材HPLC色譜圖

2.4.2 精密度試驗 取毛蕊花糖苷、alyssonoside、異毛蕊花糖苷的混合對照品溶液，在“2.1”項下的色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量為10 μl，記錄峰面積，計算儀器精密度的RSD，結(jié)果毛蕊花糖苷、alyssonoside、異毛蕊花糖苷的RSD分別為1.94%、1.20%、0.75%，表明精密度良好。

2.5 線性關(guān)系的考察 分別吸取毛蕊花糖苷儲備液 100、500、900、1 300、1 700、2 100、2 500 μl;alyssonoside 儲備液 50、150、250、350、450、550、650 μl;異毛蕊花糖苷儲備液 50、150、250、350、450、550、650 μl;然后分別依次加入到7個5 ml的容量瓶中混勻，加70%的甲醇定容至刻度。即得不同濃度的3種苯乙醇苷混合對照品溶液。然后按“2.1”項下的色譜條件進(jìn)行測定，分別進(jìn)樣10 μl，以峰面積為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得各成分回歸方程和線性范圍見表1。

表1 3個苯乙醇苷的回歸方程和線性范圍

2.6 重復(fù)性試驗 取同一產(chǎn)地螃蟹甲樣品6份，按照“2.3”項下供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，然后按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，每次進(jìn)樣10 μl，分別測定峰面積，計算含量，結(jié)果測得毛蕊花糖苷、alyssonoside、異毛蕊花糖苷含量分別為 3.15、1.10、1.35 mg/g;RSD分別為1.74%、1.99%、1.48%。

2.7 加樣回收率試驗 精密稱取適量已知含量的購自四川成都的螃蟹甲藥材粉末6份，分別精密加入一定量的毛蕊花糖苷、alyssonoside、異毛蕊花糖苷對照品，按照“2.3”項下方法制備樣品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進(jìn)行測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(n=6)

2.8 耐用性

2.8.1 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件，每次進(jìn)樣 10 μl，分別在 0、2、4、8、12、24、48、72 h 測定峰面積，結(jié)果毛蕊花糖苷、alyssonoside、異毛蕊花糖苷的 RSD分別 1.87%、1.34%、2.71%。表明樣品溶液在72 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8.2 流動相的組成比例和pH值 在研究分析方法的過程中可以看出，流動相中甲醇和水相的比例有小的變動(1%左右)，pH值在4.0～5.0之間變化，對測定結(jié)果無明顯的影響。

2.9 樣品含量測定 分別取不同來源的螃蟹甲樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件進(jìn)行測定，進(jìn)樣10 μl，采用外標(biāo)法以峰面積計算3個苯乙醇苷的含量，結(jié)果見表3。

表3 螃蟹甲中3個苯乙醇苷的測定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 本實驗首次建立了藏藥螃蟹甲中苯乙醇苷類化合物的HPLC含量測定方法，并測定了不同產(chǎn)地螃蟹甲藥材和1個螃蟹甲制劑中3個苯乙醇苷的含量，方法穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，適合于螃蟹甲的質(zhì)量控制。

3.2 在供試品制備方法上，考察了甲醇、70%甲醇和50%甲醇對苯乙醇苷提取效率的影響，結(jié)果表明以70%的甲醇作為提取溶劑效率最高。在此基礎(chǔ)上，比較了熱回流和超聲對提取結(jié)果的影響，結(jié)果表明超聲法提取效率高。以70%甲醇做提取溶劑，分別超聲30、45、60 min，結(jié)果超聲 45、60 min 均較 30 min提取完全，但兩者差異較小。故確定70%甲醇超聲提取45 min作為供試品制備方法，既簡便可靠，又不會造成有效成分的破壞。

3.3 檢測波長的選擇:利用二極管陣列紫外檢測器檢測，將對照品溶液在200～500 nm進(jìn)行在外掃描，結(jié)果表明，3個苯乙醇苷成分在330 nm波長下均有較大吸收，故選擇330 nm作為檢測波長。

3.4 實驗結(jié)果表明，在不同產(chǎn)地螃蟹甲藥材和1個螃蟹甲制劑中均檢測到3個苯乙醇苷類成分的存在，總體看來，毛蕊花糖苷＞isoacteoside＞異毛蕊花糖苷。但是，這種含量差異與其中的環(huán)烯醚萜苷類成分一樣沒有明顯的規(guī)律性［5］?？紤]到螃蟹甲藥材采集困難，樣本量較少，其普遍性還有待進(jìn)一步研究。苯乙醇苷和環(huán)烯醚萜苷類成分在螃蟹甲藥材中含量很大，很可能為螃蟹甲中的活性成分。因此，建議在建立螃蟹甲藥材及其制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的同時應(yīng)測定苯乙醇苷和環(huán)烯醚萜苷類成分。

［1］中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志(65卷第二分冊)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，1995:126，231.

［2］趙 斌，董小萍，吳健明.HPLC法測定螃蟹甲中山梔苷甲酯的含量［J］.藥物分析雜志，2009，29(2):323.

［3］張軍莉，徐 娟，李茂星.HPLC法測定了藏藥螃蟹甲中8-乙酰氧基山梔子苷甲酯的含量［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報，2009，25(3):261.

［4］靖 會，佐建鋒，李教社.苯乙醇苷類化合物的藥理研究進(jìn)展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2006，17(3):440.

［5］許敬英，蘇 奎，周 靜.苯丙素苷類化合物的研究進(jìn)展(Ⅱ)［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18(7):1770.