夏愛軍，張 琪，張?jiān)撇ǎ?園，唐 哲，周寧寧(解放軍第303醫(yī)院藥劑科，廣西南寧 530021)

1 前言

舒肝安樂寧由葉下珠、鱉甲、郁金、茵陳、黃芪、絞股藍(lán)、白花蛇舌草、梔子、甘草等中藥組成，具疏肝解郁、軟堅(jiān)散結(jié)、清肝利濕、利水消腫、解毒等功效，為解放軍第303醫(yī)院多年用于臨床治療肝炎的復(fù)方制劑，臨床療效確切。前期研究發(fā)現(xiàn)，舒肝安樂寧對(duì)四氯化碳(CCl4)所致急性肝損傷小鼠具有一定的保護(hù)作用［1］，但其對(duì)酒精性肝損傷的治療作用尚未見報(bào)道。有關(guān)小鼠急性酒精性肝損傷，國(guó)內(nèi)已有多個(gè)專家做過系統(tǒng)研究，并建立了成熟的動(dòng)物模型［2，3］。本實(shí)驗(yàn)旨在通過舒肝安樂寧對(duì)酒精誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型進(jìn)行研究，揭示其對(duì)此類損傷潛在的預(yù)防保護(hù)作用。

2 材料

2.1 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 舒肝安樂寧［自制，3.55 g(生藥)/ml，每 ml含沒食子酸不少于 0.32 mg，方中各飲片購(gòu)于南寧生源中藥飲片有限責(zé)任公司］;56°北京紅星二鍋頭白酒(北京紅星釀酒廠，用蒸餾水配制成含酒精50%的白酒);丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒(批號(hào):20071203)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒(批號(hào):20071203)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號(hào):20071112)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號(hào):20071112)，均購(gòu)自南京建成生物制劑公司;甘油三酯(TG)試劑盒(批號(hào):2008040024)購(gòu)自浙江東甌生物工程有限公司。

2.2 儀器 Centrifuge 5415D高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf);LG16-W型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);80-2離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠);722-紫外分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠);SynergyHT多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BIOTEK公司);FJ-200型高速分散勻質(zhì)機(jī)(上海標(biāo)本模型廠);TG328A型電子分析天平;Olympus光學(xué)顯微鏡。

2.3 動(dòng)物 昆明(KM)小鼠，SPF級(jí)，體重(20±2)g，雌雄各半，50只，由廣西食品藥品檢驗(yàn)所動(dòng)物中心提供(合格證號(hào):SCXK桂2003-0001)。

3 方法

3.1 動(dòng)物分組與給藥 將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、舒肝安樂寧低、中、高劑量組(5、10、20 g/kg，原生藥材量分別相當(dāng)于臨床成人給藥劑量的0.5、1、2倍)，每組10只。正常組和模型組灌胃10 ml/kg的生理氯化鈉溶液，其它各組灌胃同等容量的相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)30 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)除正常組外其余各組均1次灌胃給予50%酒精(12 ml/kg)，正常對(duì)照組給予蒸餾水。

3.2 血清AST、ALT活性的測(cè)定 末次給藥后禁食16 h，摘眼球取血，分離血清，AST和ALT活性的測(cè)定按試劑盒說明操作。

3.3 肝臟SOD活性、MDA、TG含量的測(cè)定 取血后脫頸椎處死小鼠，取出肝臟，用生理氯化鈉溶液制備成10%肝勻漿，SOD活性、MDA、TG含量的測(cè)定按試劑盒說明操作。

3.4 各組小鼠肝臟病理切片的觀察 取部分肝組織作冰凍切片，用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察。

3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以表示。

4 結(jié)果

4.1 對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠血清AST、ALT的影響 與空白組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST含量明顯升高(P＜0.01)，說明肝細(xì)胞受損，本次實(shí)驗(yàn)小鼠急性酒精性肝損傷模型制作成功。與模型組比較，舒肝安樂寧各劑量組能顯著降低小鼠血清中AST、ALT 活性 (P ＜0.05或 P ＜0.01)。結(jié)果見表1。

表1 舒肝安樂寧浸膏對(duì)酒精所致急性肝損傷小鼠血清 ALT、AST 的影響(ˉx ±s，n=10)

4.2 對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟SOD活性和MDA、TG含量的影響 與空白組比較，模型組小鼠肝臟中MDA、TG含量明顯升高，SOD活性下降。與模型組比較，舒肝安樂寧各劑量組能顯著降低小鼠肝臟中MDA、TG含量，升高SOD活性 (P＜0.05或P ＜0.01)。結(jié)果見表2。

表2 舒肝安樂寧浸膏對(duì)急性肝損傷小鼠肝臟SOD、GSH活性及MDA含量的影響( ，n=10)

表2 舒肝安樂寧浸膏對(duì)急性肝損傷小鼠肝臟SOD、GSH活性及MDA含量的影響( ，n=10)

1)P ＜0.05，2)P ＜0.01，與空白組比較;3)P ＜0.05，4)P ＜0.01，與模型組比較。

4.3 對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響 光鏡下，空白組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索放射狀排列，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，無變性壞死，核居中;肝竇無明顯擴(kuò)張淤血，匯管區(qū)未見炎細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組小鼠部分肝細(xì)胞腫脹，脂滴彌漫，核居中，部分肝竇擴(kuò)張淤血，部分肝組織見點(diǎn)狀壞死，肝小葉及匯管區(qū)見炎細(xì)胞浸潤(rùn)。舒肝安樂寧各劑量組均能減輕肝細(xì)胞腫脹程度及脂滴情況，以舒肝安樂寧高劑量組效果較好。結(jié)果表明，舒肝安樂寧可減輕酒精性肝損傷小鼠肝細(xì)胞的脂肪變性。結(jié)果見圖1。

5 討論

酒精(主要成分是乙醇)進(jìn)入機(jī)體后，約90%在肝臟內(nèi)氧化，體內(nèi)少量乙醇可在ADH和ALDH作用下代謝生成CO2和H2O排出體外。一次性大量或長(zhǎng)期慢性攝入酒精，血中乙醇濃度過高，超過肝臟正常生理代謝的解毒能力，產(chǎn)生大量自由基。過量的自由基可引起肝細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使細(xì)胞膜和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)破壞，膜流動(dòng)性失常，大量肝內(nèi)酶(AST、ALT)釋放入血，并可使清除自由基酶(SOD等)耗竭，肝細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重，肝功能異常，脂肪代謝紊亂，肝組織細(xì)胞脂肪樣和空泡樣變性，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞廣泛壞死，細(xì)胞腫脹死亡［4，5］，從而引起酒精性肝病。到目前為止，酒精性肝病已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病［6］。

SOD是生物體內(nèi)的主要抗氧化劑，通過清除生物氧化產(chǎn)生的自由基而起保護(hù)細(xì)胞的作用，其活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，是反映抗氧化損傷的主要指標(biāo);而自由基對(duì)細(xì)胞的損傷程度可通過脂質(zhì)過氧化的降解產(chǎn)物——MDA含量間接推斷。近年研究發(fā)現(xiàn)，乙醇的代謝物乙醛可以動(dòng)員皮下脂肪酸向肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，造成肝內(nèi)TG含量的升高，逐漸形成脂肪肝。TG可以評(píng)價(jià)脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)堆積情況。因而測(cè)定MDA、TG、SOD的變化可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度和藥物抗氧化能力。

舒肝安樂寧是為解放軍第303醫(yī)院多年用于臨床治療肝炎的復(fù)方制劑，由葉下珠、鱉甲、郁金、茵陳等多味中藥組成，虛實(shí)兼顧，具有活血化瘀，保肝護(hù)肝，清除自由基，增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功效［7～11］。本院多年臨床實(shí)踐證實(shí)，舒肝安樂寧治療肝炎效果明顯。前期藥理研究發(fā)現(xiàn)，本方對(duì)CCl4造成的急性肝損傷小鼠具一定的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)中，小鼠經(jīng)酒精損傷后肝功能指標(biāo)(ALT、AST)明顯升高，同時(shí)出現(xiàn)不同程度的病理改變，證明造模成功。舒肝安樂寧可以降低肝損傷小鼠血清中AST、ALT，增強(qiáng)肝臟中SOD活性，降低MDA、TG含量。其護(hù)肝作用可能與以下成分有關(guān):①葉下珠平肝清熱，利水解毒。主要有效成分沒食子酸、葉下珠素能明顯降低 ALT、AST水平［12，13］。②黃芪補(bǔ)中益氣，改善微循環(huán)，改善肝臟供血和營(yíng)養(yǎng);所含微量元素硒能提高GSH-Px活性，激活解毒酶系［14］。③絞股藍(lán)總皂苷能降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高其血漿中SOD的活性［15］。④白花蛇舌草中的多酚、黃酮、羥基蒽醌、有機(jī)酸類能改變氧化態(tài)或烯醇式與酮式官能團(tuán)互變異構(gòu)的化學(xué)特征，具有較強(qiáng)的抗氧化活性［16］。⑤郁金、茵陳、梔子、甘草臨床常用于治療各種肝膽疾病?！八幱袀€(gè)性之特長(zhǎng)，方有合群之妙用”。目前為止，舒肝安樂寧的護(hù)肝機(jī)理研究還不夠深入，還需更細(xì)致的研究，以便為臨床用藥提供可靠的理論依據(jù)。

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