金曉玲，高守紅，鄔 蓉(第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院藥學部，上海 200003)

西替?zhèn)温榫忈屍瑸辂}酸西替利嗪和鹽酸偽麻黃堿組成的復方制劑。鹽酸偽麻黃堿是麻黃堿的差向異構體，臨床所用的為右旋偽麻黃堿(PSE)，可選擇性收縮呼吸道血管，消除鼻黏膜水腫，在許多抗感冒藥中常常含有該成分［1，2］。本研究是以緩釋成分鹽酸偽麻黃堿為指標觀察人單劑量口服西替?zhèn)温榫忈屍笱帩舛冉洉r過程，估算相應的藥代動力學參數(shù)。由于偽麻黃堿血藥濃度低，需要高靈敏方法進行測定，而 HPLC 法［3～5］檢測靈敏度低，采用 GC-MS法［6］測定時需要對樣品進行衍生化處理，操作煩瑣。采用 LC-MS 法［7，8］測定血漿中偽麻黃堿的濃度，雖然方法靈敏度有所提高，但重現(xiàn)性不好，測定時間較長?？紤]到臨床生物樣本量大、穩(wěn)定性差、濃度低、專屬性要求高等特點，筆者建立了快速測定人血漿中偽麻黃堿的LC-MS/MS方法，1個樣品的測定時間僅需2.5 min，1 d能測定500多個樣品，快速而簡便地分析大量的血漿樣品，為臨床試驗提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器和藥品 Agilent 1200液相色譜-Agilent 6410型三重四極桿串聯(lián)質譜儀(美國Agilent公司);Agilent 6410 B.01.03 定量處理軟件;飛鴿牌TGL-16G高速離心機(上海安亭科學儀器廠);旋渦振蕩混和器 WL-901 Vortex(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。偽麻黃堿對照品(含量99.3%，中國藥品生物制品檢定所)。西替?zhèn)温榫忈屍?上海信誼藥業(yè)有限公司，批號090320);鹽酸金剛烷胺(內標，中國藥品生物制品檢定所);甲醇、乙腈和甲酸為色譜純試劑(德國Merck公司);水為純凈水。

1.2 色譜分離條件 色譜柱為Agilent Zorbax SBC18(150 mm × 2.1 mm，3.5 μm)，流動相為甲醇-0.1%甲酸水溶液(40∶60)，流速為0.3 ml/min，柱溫為30℃。

1.3 質譜分離條件 采用ESI離子源，正離子檢測，選擇MRM工作方式進行一/二級質譜分析。用于定量分析的檢測離子為:偽麻黃堿［M+H］+m/z 148.1→m/z 132.1，內標鹽酸金剛烷胺［M+H］+m/z152.0→m/z135.1，見圖1。干燥氣流速為 10 L/min，干燥氣溫度為350℃，霧化氣壓力為40 psi，毛細管電壓為4 000 V。

圖1 偽麻黃堿和內標的ESI-MS質譜圖

1.4 受試者與試驗設計 本臨床試驗方案經長征醫(yī)院倫理委員會審核批準，在試驗過程中受倫理委員會指導，試驗過程中無不良反應發(fā)生。10名男性健康志愿者，年齡(21.8±1.22)歲，體重(66.8±3.9)kg，肝腎功能及心電圖正常，試驗前1周及試驗期間禁用其他藥物，試驗期間禁煙、酒、茶并簽署知情同意書。在禁食12 h后，于次日晨空腹口服西替?zhèn)温榫忈屍?片(含鹽酸西替利嗪10 mg，鹽酸偽麻黃堿240 mg)，用200 ml溫開水送服。服藥后4 h方可統(tǒng)一進食標準餐。于給藥前及給藥后 0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0 和36.0 h 于靜脈取血3 ml，3 500 r/min 離心10 min，分離血漿后置 －20 ℃冰箱保存。

1.5 血漿樣品預處理 取血漿200 μl置于 －1.5 ml塑料離心管中，加入400 μl乙腈(含內標鹽酸金剛烷胺5 ng/ml)，渦旋振蕩1min，于12 000 r/min高速離心 10 min，取上清液 200 μl加入 200 μl 0.1%甲酸溶液，渦旋混勻后取10 μl進樣，峰面積內標法定量分析。

1.6 含量測定的方法學考察 用健康空白血漿精密配制成 2.5、5.0、25.0、50.0、100.0、250.0、500.0和1 000.0 ng/ml濃度的偽麻黃堿標準血漿樣品，按1.5項下方法操作，制備血漿標準曲線。配制5.0、50.0和500.0 ng/ml 3種不同濃度的偽麻黃堿血漿質控樣品，按1.5項下方法操作，進行回收率、基質效應及日內、日間精密度考察。還考察了偽麻黃堿血漿樣品經歷3次冷凍-解凍循環(huán)的穩(wěn)定性、血漿樣品經樣品處理后室溫放置24 h的穩(wěn)定性以及血漿樣品在－20℃保存60 d的穩(wěn)定性。

1.7 藥動學參數(shù)計算 采用統(tǒng)計矩法計算藥代動力學參數(shù)，Cmax、tmax采用實測值，AUC采用梯形面積法計算，λz為末端相消除速率常數(shù)，用末端相濃度對數(shù)與時間回歸直線求得:t1/2=0.693/λz。

2 結果

2.1 方法專屬性 在上述色譜條件下，偽麻黃堿和內標峰形良好，偽麻黃堿和內標的保留時間分別為1.59 min和1.82 min(圖2)。血漿中內源性雜質均不干擾藥物的測定。

2.2 方法學考察 結果表明偽麻黃堿在2.5～1 000.0 ng/ml濃度范圍內線性關系良好，回歸方程為A=0.002 3C+0.003 4(r=0.995 2)。偽麻黃堿在血漿中最低定量檢測限為2.5 ng/ml，RSD為8.46%。低、中、高3種濃度的日內及日間精密度分別＜5.7%和＜11.6%，萃取回收率 ＞78%，基質效應在103.0% ～107.7%之間。偽麻黃堿血漿樣品經歷3次冷凍-解凍循環(huán)后穩(wěn)定，RSD為9.54%;血漿樣品經樣品處理后室溫放置24 h穩(wěn)定，RSD為8.91%。血漿樣品在－20℃保存60 d其濃度無明顯變化，說明其在－20℃條件下，藥物在血漿中可穩(wěn)定存在。

2.3 藥動學結果 10名健康志愿者單劑量口服西替?zhèn)温榫忈屍?含鹽酸西替利嗪10 mg，鹽酸偽麻黃堿240 mg)，用LC-MS/MS測定其血藥濃度，按“1.7”項方法計算，體內鹽酸偽麻黃堿藥時曲線的末端相消除半衰期(t1/2)、平均駐留時間 (MRT)、峰濃度 (Cmax)、峰時間 (tmax)、AUC0～36、AUC0～∞分別為:(7.32 ± 0.97)h，(12.41 ± 1.46)h，(706.64 ±113.72)ng/ml，(6.8 ±1.0)h ，(9 269.72 ±1 598.13)ng·h/ml和(9 638.65 ±1 793.59)ng·h/ml。西替?zhèn)温榫忈屍宣}酸偽麻黃堿的體內主要藥代動力學參數(shù)與文獻報道基本一致。

3 討論

本文采用ESI正離子模式，對所測定的偽麻黃堿及其內標鹽酸金剛烷胺的電離條件進行優(yōu)化，［M+H］+峰容易生成有規(guī)律的碎片，便于MS/MS測定，經過優(yōu)化質譜和色譜條件，最終可以滿足偽麻黃堿及其內標鹽酸金剛烷胺血藥濃度的測定。

由于偽麻黃堿分子結構中含有堿性氮原子，所以流動相的pH值對其保留時間有一定影響。用甲醇-0.1%甲酸水溶液(40∶60)作為流動相時分離效果最好。因偽麻黃堿為弱堿性藥物，通常合成鹽酸鹽可增加溶解度，其血樣的提取一般采用乙醚、乙醚-正乙烷、甲基叔丁基醚等有機溶劑提取，但常有乳化現(xiàn)象產生，操作過程煩瑣，耗時長，成本較高。而采用蛋白沉淀法進行血樣處理，操作簡單，選擇沉淀劑時，曾探討使用甲醇、乙腈等蛋白沉淀劑處理生物樣品，結果使用乙腈提取回收率較高，但若用上清液直接進液質，峰形不佳且響應較低，將上清液用水、流動相、0.1%甲酸、0.3%甲酸、0.5%甲酸分別1∶1和1∶2稀釋，結果發(fā)現(xiàn)用0.1%甲酸1∶1稀釋，提取回收率最高，達78%左右。本實驗所需血漿樣品量少，前處理采用蛋白沉淀，操作簡便，分析測定時間短，在處理大批量血漿樣品時可大大減少工作量和節(jié)省時間。

偽麻黃堿在人體血漿中的濃度較低，采用HPLC-UV法測定時，有時可觀察到少量雜質干擾其低濃度測定。為保證臨床大量且復雜生物樣本分析的專屬性和準確性，本實驗建立了偽麻黃堿人血漿樣本LC-MS/MS分析方法，可以選擇性的檢測選定的離子以及該離子所產生的子離子，因而選擇性很高，而對LC的分離要求不高，甚至可以不通過LC分離而直接將混合樣品進入MS進行測定，故可以實現(xiàn)快速分離?？瞻籽獫{無雜質干擾，最低定量檢測濃度可達2.5 ng/ml，完全滿足臨床血藥濃度監(jiān)測的要求。

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