湯秀梅,劉 波,朱兆云,王京昆,字 剛

(云南省藥物研究所,云南 昆明 650111)

金七麗搽劑為云南省藥物研究所申報的中藥六類新藥項目,該復(fù)方制劑由麗江山慈菇、大黃等多味藥材組成,具有消腫止痛的功效,用于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎治療。針對痛風(fēng)的主要癥狀,選用云南的地道藥材制成復(fù)方外用制劑,該復(fù)方具有較好的民間使用基礎(chǔ),對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)痛有獨到的效果;選用高效液相色譜法測定秋水仙堿,大黃素含量,建立了定量的質(zhì)控方法,并對測定方法進行驗證研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國 Agilent 1100高效液相色譜儀,電子天平(Mettler AE163,Mettler Toledo AB204-S),HS6150D超聲清洗儀,HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋。

1.2 試藥 流動相為色譜純,其它試劑和試藥均為分析純。實驗三批制劑為云南省藥物研究所制劑中心制備。大黃素對照品,批號:110756-200110,供含量測定,購于中國藥品生物制品檢定所;秋水仙堿對照品,批號:2005985,用于 HPLC,購于Fluka。

2 方法與結(jié)果

2.1 秋水仙堿含量測定[1～4]

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Phenomenex Gemine 5 u C18110A(5μ m,Φ 4.6×250 mm);流動相:水–乙腈體積比(18∶82),流速 1.0 mL/min,檢測波長為 245 nm;進樣量 10 μ L。

2.1.2 對照品溶液的制備 取秋水仙堿對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含 48μg的溶液,即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取供試品15 g,每次用二氯甲烷15 mL,分別萃取5次,合并萃取液揮干,甲醇定容到25 mL的容量瓶中,即得。

2.1.4 陰性溶液的制備 精密稱取無麗江山慈菇樣品15 g,每次用二氯甲烷15 mL,分別萃取5次,合并萃取液揮干,甲醇定容到25 mL的容量瓶中,即得。

2.1.5 系統(tǒng)適用性實驗 按樣品含量測定項下的色譜條件,分別取對照品溶液、供試品溶液,以及麗江山慈菇的陰性樣品溶液10 μ L分別進樣分析。色譜圖如圖所示,被測組分分離效果較好,所用溶劑對檢測結(jié)果無影響,理論塔板數(shù)不低于6000。

圖1 專屬性試驗色譜圖

2.1.6 線性試驗 精密稱取秋水仙堿對照品26.36 mg,置10 mL量瓶中,加適量甲醇溶解,定容至刻度,搖勻,作為母液備用。分取 1.0 mL 置 2、5、25、50、100、250 mL 量瓶中,甲醇稀釋至刻度,搖勻,再取 25 mL容量瓶中的 1 mL定容至25 mL,用 0.45 μ m濾膜過濾作為對照品溶液,按上述方法各進樣 10 μ L,檢測,以濃度(mg/mL)為橫坐標,面積為縱坐標,得回歸方程:Y=33765X-88.741,R=1;結(jié)果表明秋水仙堿在 0.04218～13.18μ g范圍內(nèi)該方法線性關(guān)系良好。

2.1.7 精密度試驗 取配制好的對照品溶液,連續(xù)進樣6針,以峰面積計算,結(jié)果秋水仙堿峰的RSD為0.92%。

2.1.8 重復(fù)性試驗 稱取同一批供試品,按照制備方法同時制成 6份供試品溶液,進樣 10 μ L,測定。測定結(jié)果的 RSD為1.30%。

2.1.9 中間精密度試驗 不同人員稱取同一批供試品,按照制備方法分別制成3份供試品溶液,進樣10 μ L,測定。測定結(jié)果的RSD為1.08%。

2.1.10 范圍 取同一批樣品,按供試品取樣量的50%、100%、200%分別稱取,制備測定大黃素含量,測定結(jié)果表明,測試方法取樣量的濃度50%～200%,RSD為 1.32%達到要求。

2.1.11 穩(wěn)定性試驗 取已配制好的供試品溶液依法測定,分別于 0、1、3、6、12、18、24 h 進樣,以峰面積計算,結(jié)果 RSD為1.91%,所得的樣品中秋水仙堿峰面積基本一致,說明樣品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.12 加樣回收率試驗 取9份供試品(測含量為3.7714×10-3%),精密稱定,分置已編號為 1至9的25 mL量瓶中,在 1、2、3號錐形瓶中分別加入濃度為0.3618 mg/mL的秋水仙堿對照品溶液各1 mL,在4、5、6號錐形瓶中分別加入濃度為0.3618 mg/mL的秋水仙堿對照品溶液各2 mL,在7、8、9號錐形瓶中分別加入濃度為 0.3618 mg/mL的秋水仙堿對照品溶液各3 mL,然后按供試品制備方法同法處理,依法測定,計算回收率,結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.1.13 樣品含量測定 照高效液相色譜法(《中國藥典》2005年版一部(附錄ⅥD))測定。依法操作,測定3批樣品,結(jié)果見表2。

表2 3批樣品含量測定結(jié)果

根據(jù)3批樣品的測定結(jié)果,在測定值的基礎(chǔ)上,低值向下浮動 20%,即 44.2μg/g×80%=35.36μg/g,高值向上浮動20%,95.0×120%=114μg/g,將本品的含量限度定為:本品每1 g中含秋水仙堿應(yīng)為30～120μg。

2.2 大黃素含量測定[5～7]

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Phenomenex Gemine 5u C18110A(5 μ m,Φ 4.6×250 mm);以甲醇-0.1%磷酸溶液體積比(70∶30)為流動相;檢測波長為254 nm;進樣量10 μ L。

2.2.2 對照品溶液的制備 取大黃素對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含50μg的溶液,即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取供試品12.5 g,精密稱定,置25 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 取無大黃的樣品12.5 g,精密稱定,置25 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度即得。

2.2.5 系統(tǒng)適用性 按樣品含量測定項下的色譜條件,分別取對照品溶液、供試品溶液,以及大黃的陰性樣品溶液10 μ L分別進樣分析。色譜圖如圖2所示,被測組分分離效果較好,所用溶劑對檢測結(jié)果無影響,理論塔板數(shù)不低于4500。

圖2 專屬性試驗色譜圖

2.2.6 線性試驗 精密稱取大黃素對照品12.57 mg,置25 mL量瓶中,加適量甲醇溶解后定容至刻度,搖勻,作為母液備用。精密量取 1.0 mL 置 2、5、10、50、100 mL量瓶中,甲醇稀釋至刻度,搖勻,用 0.45 μ m 濾膜過濾,按上述方法分別進樣 10 μ L,結(jié)果以濃度(mg/mL)為橫坐標,面積為縱坐標,得回歸方程:Y=28022x-7.4194,R=0.9997;以上結(jié)果表明該方法在 0.05028～5.028μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.7 精密度試驗 取配制好的對照品溶液按照含量測定方法依法測定,連續(xù)進樣6針,以峰面積計算,結(jié)果大黃素的RSD為0.22%(n=6)。

2.2.8 重復(fù)性試驗 稱取同一批供試品,按照制備方法同時制成6份供試品溶液,進樣10 μ L,測定。以峰面積計算含量,測定結(jié)果的RSD為1.24%(n=6)。

2.2.9 中間精密度試驗 不同人員稱取同一批供試品,按照制備方法分別制成 3份供試品溶液,進樣 10 μL,測定。測定結(jié)果的RSD為1.98%。

2.2.10 范圍 取同一批樣品,按供試品取樣量的50%、100%、200%分別稱取,制備測定大黃素含量,測定結(jié)果表明,測試方法取樣量的濃度50%～200%,RSD為 0.97%達到要求。

2.2.11 穩(wěn)定性試驗 稱取已配制好的供試品溶液按照含量測定方法依法測定,分別于 0、1、2、5、11、17、24 h 進樣,進樣體積10 μ L,結(jié)果 RSD為1.26%(n=7),說明樣品在 24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.12 加樣回收率試驗 取9份供試品(測含量為1.0059%×10-2%),精密稱定,分置已編號為1至9的25 mL量瓶中,在1、2、3號錐形瓶中分別加入濃度為0.5224 mg/mL的大黃素對照品溶液各1 mL,在 4、5、6號錐形瓶中分別加入濃度為0.5224 mg/mL的大黃素對照品溶液各2 mL,在7、8、9號錐形瓶中分別加入濃度為0.5224 mg/mL的大黃素對照品溶液各3 mL,然后按供試品制備方法同法制備,進樣測定,計算回收率,結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果

2.2.13 樣品含量測定 照高效液相色譜法(《中國藥典》2005年版一部(附錄ⅥD))測定。依法操作,測定3批中試樣品,結(jié)果見表4。

表4 3批中試樣品含量測定結(jié)果

根據(jù)3批樣品測定結(jié)果,在此均值105.3%的基礎(chǔ)上向下浮動 20%,即 105.3μg/g ×80%=73.7μg/g,故取不低于70μg/g作為本品大黃素的含量限度。

3 討論

金七麗搽劑處方中麗江山慈菇為主藥,含秋水仙堿,秋水仙堿是針對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有效的抗炎劑,對痛風(fēng)急性發(fā)作有特別顯著的治療效果,也是有效的預(yù)防藥。秋水仙堿是麗江山慈菇藥材中治療痛風(fēng)的有效成分,在含量測定中選用秋水仙堿為指示物;大黃藥材的現(xiàn)代藥理研究顯示,大黃素為大黃藥材的活性成分,在不同代謝系統(tǒng)方面都具有明顯的藥理活性,在制劑的含量測定研究中,選用大黃素作為指標物。

選擇秋水仙堿含量測定的流動相,根據(jù)文獻資料,試驗了0.05 mol/L磷酸二氫鉀與甲醇不同比例的流動相,出峰較集中在前面,幾乎找不到秋水仙堿峰;試驗0.1%磷酸溶液與乙腈的不同比例流動相,可以得到秋水仙堿峰分離效果較好,出峰時間在35 min,考慮到酸液對柱子的損害較大,試用水代替0.1%磷酸溶液,結(jié)果不斷調(diào)整流動相比例,得到乙腈–水(18∶82),分離度為1.5左右。

在確定秋水仙堿、大黃素含量測定的方法,驗證耐用性試驗。分別試驗色譜柱:Waters-synnery,Thermo Bds hypersil C18,Phenomenex Gemine 5u C18110A;流速:1.2 mL/min,1.0 mL/min,0.8 mL/min,;柱溫:10℃、20℃、30℃。結(jié)果表明3種柱子,3種流速,3種柱溫在相同的色譜條件下,分離度在1.5以上。

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