閭宏偉 陳淑華 黃利華 向 紅 陽國平 鄧 昊 黃志軍 袁 洪

(中南大學湘雅三醫(yī)院醫(yī)學實驗中心，湖南 長沙 410013)

衰老是心血管疾病的主要風險因子之一，內(nèi)皮功能的改變在血管老化中發(fā)生最早。作為早期的病理生理改變，衰老所致的血管內(nèi)皮功能障礙在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。同時，內(nèi)皮細胞衰老過程中，細胞的增殖、凋亡和其他功能也會發(fā)生相應的改變。探索衰老內(nèi)皮細胞增殖、凋亡和其他功能的變化，以及可能的發(fā)生機制，有助于延緩血管衰老，降低老年人心腦血管性疾病發(fā)病率和死亡率〔1～3〕。筆者前期研究已經(jīng)證實了體外培養(yǎng)的衰老內(nèi)皮細胞的遷移和血管生成能力均有所下降，并與S1P2受體表達存在一定的相關性〔4～6〕。本研究旨在初步探討衰老內(nèi)皮細胞的增殖和凋亡改變，以及與細胞S1P2受體表達的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源與采集 標本均來自于中南大學湘雅三醫(yī)院婦產(chǎn)科正常足月妊娠娩出的新生兒臍帶。于無菌條件下剪下臍帶放入裝有M199培養(yǎng)基的無菌容器中，快速移入實驗室，1 h內(nèi)行臍靜脈內(nèi)皮細胞的分離培養(yǎng)。

1.1.2 試劑 M199培養(yǎng)基，胎牛血清(Hyclone);L-谷氨酰胺(Sigma公司);胰蛋白酶(Amresco公司);膠原酶Ⅰ、Ⅱ，青-鏈霉素(Gibco公司);S1P(biomol公司);BSA(Sigma公司);MTT(武漢博士德生物公司);Annexin V-FITC/PI試劑盒(BD公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細胞的分離和培養(yǎng) 將取來的臍帶迅速移入潔凈操作臺內(nèi)，無菌條件下將其放入提前盛有預熱PBS的培養(yǎng)皿中，擠出臍帶中的血，用剪刀修齊兩斷面，分成約20 cm的一段。找出臍靜脈，用帶平針頭的注射器從一端插入臍靜脈，血管鉗固定，再用預熱的PBS沖洗3次以上，將血跡完全沖洗干凈。從沖洗的針頭中注入0.1%膠原酶Ⅱ使其充盈，另一條以同樣的方法注入0.1%膠原酶Ⅰ和0.25%胰酶等比混合消化液。取出針頭，用止血鉗夾住注入端，移入無菌燒杯中，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育13 min。取出，松開注入端的血管鉗，收集臍靜脈內(nèi)的消化液，然后注入含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液再次沖洗管腔，將消化液與沖洗液一并收集于離心管，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加入M199完全培養(yǎng)液〔含20%胎牛血清、5 U/ml肝素、50 μg/ml內(nèi)皮細胞生長補充物 (ECGS)、100 U/ml青霉素和鏈霉素〕，輕輕吹打均勻，按4×105個細胞種植在直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天傳代一次;計算細胞的累積細胞群體倍增值 (CPDL);當細胞的CPDL=60時，作為衰老細胞組 (S)，同時運用β-半乳糖苷酶染色來證實細胞的衰老;另分別于細胞的CPDL為15、35時，收集內(nèi)皮細胞，作為年輕細胞組 (Y)和中年細胞組 (I)。

1.2.2 RT-PCR檢測Y、I和S內(nèi)皮細胞S1P2受體mRNA的表達 用TRIzolTM試劑提取每組細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin作為內(nèi)對照，采用RT-PCR半定量檢測內(nèi)皮細胞的S1P2受體mRNA的表達。引物序列分別為:S1P2前向:CAAGTTCCACTCGGCAATGT， S1P2 反 向:CAGGAGGCTGAAGACAGAGG;β-actin前向:GAGACCTTCAACACCCCAG，β-actin反向:TCAGGTCCCGGCCAGCCA。方法如下:樣品94℃預變性2 min，94℃變性20 s，60℃復性20 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)后，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠 (含溴乙啶0.5 mg/L)電泳檢測。平行實驗重復3次。

1.3 MTT法分析Y、I和S組內(nèi)皮細胞的增殖 用含10%胎小牛血清的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔1 000～10 000個細胞接種到96孔板，每孔體積200 μl。培養(yǎng)至細胞達90%融合。每孔加 MTT溶液 (5 mg/ml用 PBS配制，pH7.4)20 μl，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150 μlDMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以細胞分組為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.4 流式細胞術分析Y、I和S組內(nèi)皮細胞的凋亡 收集培養(yǎng)的Y、I和S組內(nèi)皮細胞，調(diào)整細胞濃度至1×106個/ml。每 100 μl的細胞懸液加 5 μl的 AnnexinV-FITC 和 1 μl PI工作液 (100 μl/ml)，根據(jù)Annexin V-FITC/PI試劑盒說明處理細胞，流式細胞儀檢測各組內(nèi)皮細胞的凋亡。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測Y、I和S組內(nèi)皮細胞S1P2受體mRNA的表達 年輕內(nèi)皮細胞S1P2受體mRNA的表達顯著低于衰老內(nèi)皮細胞 (P＜0.01)。見圖1。

2.2 MTT法分析Y、I和S組內(nèi)皮細胞的增殖 S組內(nèi)皮細胞的增殖能力 (0.451±0.033)明顯低于 Y和 I組細胞(0.887±0.016，0.683±0.021，P＜0.01)。

2.3 流式細胞術分析Y、I和S組內(nèi)皮細胞的凋亡 S組內(nèi)皮細胞的凋亡率顯著高于Y和I組 (P＜0.01)。見圖2。

圖1 Y、I和S組內(nèi)皮細胞的S1P2受體mRNA表達

圖2 流式細胞術分析Y、I和S組內(nèi)皮細胞的凋亡

3 討論

細胞在體外培養(yǎng)一定代齡后，細胞增殖能力下降，最終生長停滯，細胞DNA合成能力下降，細胞周期阻滯于G1末期，不能進入S期，該過程稱復制性衰老。細胞水平的復制性衰老作為研究整體衰老的體外模型，已被廣泛認可。發(fā)生復制性衰老的不同類型細胞，有截然不同的凋亡敏感性，有的促進凋亡，有的抑制凋亡，細胞凋亡參與了整個衰老過程，并在其中各個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要的作用。有些細胞衰老抑制細胞的凋亡，如Wang等〔7〕報道了去血清誘導鼠及人的成纖維細胞時，衰老細胞同年輕細胞相比，不易發(fā)生凋亡。Fung等〔8〕也報道衰老的嗅上皮細胞不容易發(fā)生凋亡。有些細胞衰老促進細胞凋亡，如Adams等〔9〕用視黃酸誘導關節(jié)軟骨細胞的凋亡，發(fā)現(xiàn)隨增齡軟骨細胞容易發(fā)生凋亡。Hashimoto等〔10〕進一步發(fā)現(xiàn)，體外軟骨細胞源性的凋亡小體具有堿性磷酸酶和NTP焦磷酸水解酶活性，能夠使鈣沉積，提示隨增齡軟骨細胞凋亡的增加可能與老年人易軟骨鈣化和患關節(jié)炎有關。對細胞衰老促進凋亡的機制，尚無系統(tǒng)闡述，一般認為衰老細胞線粒體DNA損傷、能量代謝障礙及自由基損傷導致其容易凋亡。

目前，衰老內(nèi)皮細胞的增殖與細胞凋亡未見相關報道，本研究表明衰老內(nèi)皮細胞的增殖能力明顯下降和細胞凋亡明顯增加，同時初步闡明了衰老內(nèi)皮細胞的S1P2受體表達上調(diào)與內(nèi)皮細胞增殖能力下降及細胞凋亡增加相關聯(lián)。這為進一步研究S1P2受體介導內(nèi)皮細胞衰老的機制及老年人心腦血管性疾病的預防和治療提供了新的研究思路。

1 Erusalimsky JD，Kurz DJ.Cellular senescence in vivo:its relevance in ageing and cardiovascular disease〔J〕.Exp Gerontol，2005;40(8-9):634-42.

2 Behrendt D，Ganz P.Endothelial function:from vascular biology to clinical application〔J〕.Am J Cardiol，2002;90(supplⅡ):40-8.

3 黃亞莉，陸 彤.衰老與血管內(nèi)皮功能障礙〔J〕.心血管病學進展，2007;28(5):766-70.

4 閭宏偉，陳淑華，陽國平，等.血管內(nèi)皮細胞衰老過程中S1P2受體表達和細胞功能改變的相關性〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(4):404-6.

5 閭宏偉，陳淑華，陽國平，等.S1P2受體shRNA腺病毒載體的構(gòu)建及篩選〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(5):527-30.

6 Estrada R，Zeng Q，Lu HW，et al.Up-regulating sphingosine-1-phosphate receptor-2 signaling impairs chemotactic，wound-healing，and morphogenetic responses in senescent endothelial cells〔J〕.J Biol Chem，2008;31:283(44):30363-75.

7 Wang E，Lee MJ，Pandey S.Control of fibroblast senescence and activation of programmed cell death〔J〕.J Cell Biochem，1994;54(4):432-9.

8 Fung KM，Peringa J，Venkatachalam S，et al.Coordinate reduction in cell proliferation and cell death in mouse olfactory epithelium from birth to maturity〔J〕.Brain Res，1997;761(2):347-51.

9 Adams CS，Horton WE Jr.Chondrocyte apoptosis increases with age in the articular cartilage of adult animals〔J〕.Anat Rec，1998;250(4):418-25.

10 Hashimoto S，Ochs RL，Rosen F，et al.Chondrocyte-derived apoptotic bodies and calcification of articular cartilage〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，1998;95(6):3094-9.