納 寧， 何善陽， 徐 霖， 陳 康， 趙 湛， 廖 冰， 曹開源

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院腎移植科，廣東 廣州 510630;2中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院黃埔院區(qū)婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510700;3中山大學(xué)熱帶病防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510080;4東莞市中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東東莞 523000;3中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，廣東廣州 510080)

移植物抗宿主病(graft－versus－h(huán)ost disease，GVHD)是同種異體骨髓移植(allogeneic bone marrow transplantation，allo－BMT)后最主要的并發(fā)癥之一，它的發(fā)生嚴(yán)重影響著移植后的生存時(shí)間和生存質(zhì)量。GVHD的發(fā)生主要是由于植入的供者免疫活性細(xì)胞識(shí)別受者的移植抗原，產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，使受者的組織細(xì)胞受到免疫反應(yīng)的攻擊而受損，可累及全身多個(gè)組織器官，嚴(yán)重時(shí)可致病人死亡，其中皮膚、肝臟和胃腸道是最主要的受損器官。本課題組近年來致力于不成熟CD8α+樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)誘導(dǎo)免疫耐受的研究，已成功建立起不成熟CD8α+DC的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)體系［1－3］，并通過體外實(shí)驗(yàn)證明其具有分泌高水平白細(xì)胞介素10(interleukin－10，IL－10)，抑制同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的作用［4］，但其體內(nèi)防治GVHD的功能尚有待進(jìn)一步證實(shí)。因此，本研究通過建立小鼠EL9611紅白血病和急性GVHD動(dòng)物模型，并通過臨床表現(xiàn)、病理改變和生存時(shí)間等指標(biāo)評(píng)估動(dòng)物模型的可靠性，為不成熟CD8α+DC防治急性GVHD和保留移植物抗白血病(graft－versus－leukemia，GVL)的研究打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

材料和方法

1 動(dòng)物

4－6周雄性 SPF級(jí) C57BL/6小鼠(合格證號(hào)為0017563)，4－6周雄性 SPF級(jí) BALB/c小鼠(合格證號(hào)為0013056)，均由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有GVHD及紅白血病模型鼠(BALB/c鼠)均飼養(yǎng)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF實(shí)驗(yàn)環(huán)境中(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用證號(hào)為0006523)。EL9611紅白血病細(xì)胞株購自天津中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所。

2 EL9611紅白血病動(dòng)物的傳代［5］

采用體內(nèi)傳代的方法，無菌條件下取紅白血病BALB/c小鼠脾臟，剪碎后經(jīng)不銹鋼濾網(wǎng)過濾，PBS洗滌1次，離心去上清，加入0.15 mol/L NH4Cl紅細(xì)胞裂解液處理，洗滌2次，計(jì)數(shù)。尾靜脈注射白血病鼠脾細(xì)胞2×106個(gè)/鼠建立EL9611紅白血病動(dòng)物模型。觀察小鼠的存活時(shí)間、肝脾稱重并進(jìn)行病理檢查，發(fā)病晚期鏡下計(jì)數(shù)外周血白細(xì)胞(white blood cell，WBC)數(shù)目，并涂片進(jìn)行Giemsa染色鏡檢。當(dāng)外周血WBC＞3.0×1010/L時(shí)拉頸處死，取脾細(xì)胞傳代。

3 同種異基因骨髓移植(allo－BMT)［6］

以allo－BMT當(dāng)天為第0 d，EL9611紅白血病鼠第－7 d每只小鼠接種2×106白血病細(xì)胞;第－5 d開始，飲用水中添加慶大霉素320 mg/L和紅霉素250 mg/L;第0 d進(jìn)行1次性全身致死劑量的［60Co］γ射線照射治療，照射劑量8.0 Gy;照射后5 h內(nèi)進(jìn)行骨髓移植，每只小鼠經(jīng)尾靜脈輸注同種異基因C57BL/6(H－2b)小鼠骨髓細(xì)胞2×106+脾細(xì)胞1×107，輸注總劑量0.5 mL/只。移植后第3 d撤去紅霉素和慶大霉素，觀察小鼠臨床表現(xiàn)，包括:精神狀態(tài)、活動(dòng)能力、體位改變、皮毛、體重、大便等，記錄每只小鼠的生存時(shí)間、計(jì)算存活率并繪制生存曲線。病理檢查瀕死小鼠的皮膚、肝臟、小腸。

4 實(shí)驗(yàn)分組

白血病組:n=10，第－7 d每只小鼠尾靜脈輸注2×106白血病細(xì)胞，不進(jìn)行［60Co］γ射線照射，尾靜脈輸注PBS 0.5 mL。照射對(duì)照組:n=4，第－7 d每只小鼠尾靜脈輸注2×106個(gè)EL9611細(xì)胞，經(jīng)1次［60Co］γ射線8.0 Gy照射，照射后不進(jìn)行allo－BMT，尾靜脈輸注PBS 0.5 mL，照射后第7 d開始每天計(jì)數(shù)WBC。GVHD組:n=10，第0 d進(jìn)行1次8.0 Gy的［60Co］γ射線照射，照射后進(jìn)行allo－BMT，建立EL9611白血病鼠的急性GVHD模型。正常對(duì)照組:n=4，正常BALB/c小鼠未進(jìn)行照射，第0 d尾靜脈輸注PBS 0.5 mL。

5 病理學(xué)檢查

各組織經(jīng)常規(guī)10%甲醛－PBS固定、石蠟切片、HE染色檢查。白血病組進(jìn)行肝、脾HE染色，血涂片行Giemsa染色觀察。照射對(duì)照組取瀕死鼠的股骨進(jìn)行骨髓病理切片和HE染色。GVHD組進(jìn)行肝、皮膚、小腸的組織切片和HE染色;以正常對(duì)照組小鼠相應(yīng)的組織切片作為正常對(duì)照。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 EL9611紅白血病動(dòng)物模型的建立

接種2×106個(gè)白血病細(xì)胞的EL9611紅白血病鼠平均生存時(shí)間為(14.5±2.1)d，死亡率100%，無自發(fā)緩解，死亡時(shí)肝脾腫大，肝重(2.40±0.48)g，脾重(0.84±0.20)g，與正常對(duì)照組［肝(1.05±0.15)g，脾(0.07±0.01)g］相比P＜0.01。外周血WBC升高，死亡前1－2 d WBC計(jì)數(shù)為(3.33±0.27)×1010/L，與正常對(duì)照組［(1.37±0.23)×1010/L］相比，P＜0.05。外周血涂片中可見異形白血病細(xì)胞，肝脾病理檢查示脾臟正常結(jié)構(gòu)被破壞，彌漫性白血病細(xì)胞浸潤，核分裂相與凋亡相較多，肝臟中有大量白血病細(xì)胞浸潤灶，見圖1A－C，結(jié)果符合文獻(xiàn)報(bào)道EL9611紅白血病的表現(xiàn)［5］。

Figure 1.The pathological analysis in leukemia group and radiation control group.Mice in leukemia group received 2×106/mouse of EL9611 erythroleukemic cells via tail vein on day－7.Mice in radiation control group received 2×106/mouse of EL9611 erythroleukemic cells on day－7 and 8.0 Gy［60Co］γ TBI on day 0 without allo－BMT.A:liver of mice in leukemia group(HE staining，×400);B:spleen of mice in leukemia group(HE staining，×400);C:peripheral blood of mice in leukemia group(Giemsa staining，×800);D:bone marrow of mice in radiation control group(HE staining，×100).圖1 白血病組和照射對(duì)照組小鼠的病理表現(xiàn)

2 EL9611紅白血病鼠急性GVHD模型的建立

照射對(duì)照組經(jīng)照射后外周血白細(xì)胞進(jìn)行性下降，第8 d以后WBC降為0，出現(xiàn)皮下出血等凝血功能下降癥狀，骨髓病理顯示無造血增生，骨髓被脂肪組織取代，表明死于造血衰竭，8.0 Gy為致死性照射劑量，見圖1D。GVHD組小鼠移植10－13 d后開始出現(xiàn)消瘦，死亡時(shí)體重(11.00±0.97)g，與正常對(duì)照組(15.60±1.90)g相比，P＜0.05，以及弓背、豎毛、精神萎靡、皮毛脫落、腹瀉等典型的GVHD臨床癥狀［6］，病理檢查顯示皮膚角化不良，表皮與真皮之間出現(xiàn)裂隙，交界處血管充血，真皮層炎癥細(xì)胞浸潤;肝臟中央靜脈充血，匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤;小腸可見腸黏膜上皮細(xì)胞脫落，黏膜下層炎癥細(xì)胞浸潤，其病理表現(xiàn)符合Ⅰ到Ⅱ度GVHD的改變，未見白血病征象，見圖2。

3 各組小鼠生存時(shí)間分析

未進(jìn)行BMT的照射對(duì)照組TBI后外周血WBC進(jìn)行性減少，第8 d以后降為0，出現(xiàn)皮下出血等血小板減少征象，平均生存時(shí)間為(9.00±0.71)d，生存時(shí)間與GVHD組及正常對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.01)，死亡率100%;未照射的白血病組平均生存時(shí)間為(7.50±0.65)d(以照射當(dāng)天為第0 d)，生存時(shí)間與GVHD組及正常對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.01)，死亡率100%;GVHD對(duì)照鼠平均生存時(shí)間為(32.00±3.17)d，生存時(shí)間與其它各組相比差異顯著(P＜0.01)。各組的生存曲線見圖3。

Figure 2.The pathological analysis and appearance of mice in GVHD group.Mice in GVHD group received 2×106/mouse of EL9611 erythroleukemic cells on day －7 and 8.0 Gy［60Co］γ TBI on day 0，then received allo－BMT of 2×106C57BL/6 bone marrow cells+1 ×107C57BL/6 spleen cells.A:skin(HE staining，×400);B:liver(HE staining，×400);C:small intestine(HE staining，×400);D:clinical manifestation of hunched back and depilation 10－13 d after allo－BMT.圖2 GVHD組的病理和臨床表現(xiàn)

Figure 3.The survival curve analysis among different groups.Mice in leukemic group received 2×106/mouse of EL9611 erythroleukemia cells via tail vein on day－7.Mice in radiation control group received EL9611 leukemia cell infusion on day －7 and 8.0 Gy［60Co］γ TBI on day 0 without allo－BMT.Mice in GVHD group received EL9611 leukemia cell infusion on day－7 and 8.0 Gy［60Co］γ TBI on day 0，then received allo－BMT of 2×106C57BL/6 bone marrow cells+1 ×107C57BL/6 spleen cells.圖3 各組小鼠的生存分析

討 論

GVHD的發(fā)生嚴(yán)重影響骨髓移植患者術(shù)后的生存時(shí)間和生存質(zhì)量。如何在防治GVHD的同時(shí)保留移植物抗感染和GVL效應(yīng)已成為臨床上開展骨髓移植和治療白血病需要解決的難題之一。耐受性DCs為GVHD的防治提供了新的思路［7，8］。本課題組近年來已成功建立了不成熟CD8α+DCs的體外培養(yǎng)方法［1－3］，體外實(shí)驗(yàn)已證明所誘導(dǎo)的 CD8α+DCs具有抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的功能［4］，但其體內(nèi)功能仍需進(jìn)一步確證。建立白血病小鼠的GVHD動(dòng)物模型是研究GVHD尤其是GVL效應(yīng)機(jī)制和防治研究的重要基礎(chǔ)，但目前國內(nèi)對(duì)于GVL效應(yīng)機(jī)制的研究很少，未見相關(guān)動(dòng)物模型的報(bào)道，因此，本研究建立了白血病小鼠的GVHD動(dòng)物模型，為不成熟CD8α+DC防治GVHD和GVL效應(yīng)的研究提供實(shí)驗(yàn)條件。本研究所選取的EL9611紅白血病模型是國內(nèi)建立的可移植性白血病動(dòng)物模型，白血病細(xì)胞主要侵及骨髓、脾及肝臟，晚期外周血中可見大量瘤細(xì)胞，對(duì)常用化療藥物敏感，是較理想的動(dòng)物模型之一［5］。目前國內(nèi)尚無白血病聯(lián)合GVHD動(dòng)物模型建立的報(bào)道，而國外白血病和GVHD小鼠模型的建立常采用 C1498、A20、P815 等細(xì)胞株［9，10］，未見應(yīng)用紅白血病細(xì)胞株來建GVHD動(dòng)物模型的報(bào)道，采用EL9611紅白血病細(xì)胞株建立起來的白血病GVHD動(dòng)物模型國內(nèi)外更是未見相關(guān)報(bào)道。本研究中，接種2×106個(gè)白血病細(xì)胞的白血病組平均生存時(shí)間為(14.5±2.1)d［以照射當(dāng)天為第0 d，則為(7.5±0.7)d］，死亡率100%，無自發(fā)緩解，死亡時(shí)肝脾腫大，外周血WBC升高(P＜0.05)，病理檢查證實(shí)外周血中出現(xiàn)多量體積大、核異形的白血病細(xì)胞，并可見核分裂相，肝脾中均有大量白血病細(xì)胞浸潤，易見凋亡相與核分裂相，正常組織被破壞，符合白血病的病理改變［5］(圖1A－C)，表明EL9611紅白血病模型建立成功。本研究選在傳代7 d后即白血病的中期進(jìn)行allo－BMT，照射前飲用水中添加紅霉毒與慶大霉素預(yù)防TBI后發(fā)生嚴(yán)重感染。由于小鼠較人類易于誘導(dǎo)免疫耐受，單純骨髓移植往往難于誘導(dǎo)出致死性GVHD，可能出現(xiàn)部分小鼠的GVHD癥狀自發(fā)緩解而長期存活的現(xiàn)象，病理改變也較輕，致死性GVHD病理檢查常不過是Ⅰ－Ⅱ度，難以產(chǎn)生如同人類的Ⅲ－Ⅳ度的病理改變。因此，誘導(dǎo)出致死性的、癥狀典型的GVHD往往需要同時(shí)添加成熟淋巴細(xì)胞才能實(shí)現(xiàn)［6］。本研究中采用TBI后每只受鼠靜脈輸注同種異基因供鼠骨髓細(xì)胞2×106+脾細(xì)胞1×107的方法建立GVHD的動(dòng)物模型。照射對(duì)照組在TBI后外周血WBC進(jìn)行性減少，第8天以后降為0，出現(xiàn)皮下出血等血小板減少征象，平均生存時(shí)間為(9.00±0.71)d，死亡率100%，病理檢查證實(shí)骨髓造血衰竭(圖1D)，表明8.0Gy的照射劑量是致死性的合適劑量。GVHD組在移植后10－13天開始出現(xiàn)精神萎靡、消瘦、弓背、豎毛、脫毛(嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)表皮結(jié)痂脫落)、腹瀉等GVHD的臨床癥狀(圖2)，與文獻(xiàn)報(bào)道的典型癥狀一致［6］，死亡率100%，病理檢查顯示皮膚、肝臟、小腸的病理表現(xiàn)符合Ⅰ到Ⅱ度GVHD的改變(圖2)，未見白血病細(xì)胞浸潤，生存期(32.00±3.17)d與照射對(duì)照組及白血病組相比均差異顯著(P＜0.01)，表明TBI加allo－BMT可以產(chǎn)生抗白血病的治療作用，allo－BMT可延長照射后小鼠的存活時(shí)間并恢復(fù)造血。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EL9611紅白血病鼠的急性GVHD動(dòng)物模型建立成功，為GVHD防治和GVL效應(yīng)的進(jìn)一步研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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