符江琳， 劉承云， 徐 曉， 劉存飛， 陳星霖

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院老年科，湖北 武漢 430022)

隨著心臟介入治療技術(shù)的成熟，缺血心肌經(jīng)血運(yùn)重建后引起的心肌細(xì)胞凋亡早已引起人們的關(guān)注。大量研究表明通過抑制心肌細(xì)胞凋亡可以減少缺血再灌注后的心肌細(xì)胞損傷［1］。磷脂酰肌醇3－激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol 3－kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)通路控制著哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的許多調(diào)節(jié)反應(yīng)，如抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、新陳代謝及細(xì)胞肥大［2］。生長停滯特異性蛋白6(growth arrest－specific protein 6，Gas6)是近些年發(fā)現(xiàn)的具有抗凋亡作用的細(xì)胞因子，屬于受體酪氨酸激酶亞家族成員的配體之一。早期不少研究均證實(shí)Gas6能通過激活PI3K/Akt存活通路，減少血清剝奪或低糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞凋亡［3－5］。最近又有報(bào)道在肝臟細(xì)胞缺血再灌注損傷中，Gas6能通過活化PI3K/Akt通路對(duì)肝細(xì)胞起保護(hù)作用［6］。本研究旨在利用H9c2細(xì)胞急性缺氧復(fù)氧模型，模擬心肌缺血再灌注損傷，觀察Gas6對(duì)H9c2細(xì)胞急性缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響，并初步探討其與PI3K/Akt通路的關(guān)系。

材料和方法

1 材料

H9c2細(xì)胞系(武漢博士德公司)、DMEM高糖和低糖型培養(yǎng)基(Gibco)、胎牛血清(杭州四季青)、重組人Gas6(R＆D)，Annexin p－Akt V/PI凋亡試劑盒(AntiGene)、兔抗大鼠磷酸化 Akt抗體(p－Akt Ser473)(Cell Signaling Technology)、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔IgG(武漢谷歌公司)、caspase－3活性檢測試劑盒(南京建成有限公司)。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 H9c2細(xì)胞系培養(yǎng) 以2×107cells/L密度接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱(95%空氣)中培養(yǎng)，2－3 d后用0.25%胰酶消化傳代1次，分別以1×107cells/L或1×108cells/L密度接種于96孔或6孔培養(yǎng)板中，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(anoxia/reoxygenation，A/R)模型的構(gòu)建 按照先前文獻(xiàn)中方法［7］改進(jìn)后，用氮?dú)獬浞诸A(yù)先飽和無血清低糖DMEM培養(yǎng)基30 min(流量為2 L/min)，使溶解氧分壓從20 kPa降至4 kPa。將上述細(xì)胞培養(yǎng)基快速置換細(xì)胞培養(yǎng)板中的含血清的高糖培養(yǎng)基，并將細(xì)胞培養(yǎng)板置入充滿氮?dú)獾拿荛]裝置內(nèi)，37℃細(xì)胞培養(yǎng)3 h后換為正常培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱(95%空氣)復(fù)氧3 h。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 分別取6孔板中正常培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞隨機(jī)分4組:正常組(control組):37℃ 、5%CO2培養(yǎng)箱(95%空氣)正常培養(yǎng);缺氧/復(fù)氧組(A/R組):按照上述構(gòu)建模型;缺氧/復(fù)氧+Gas6組(A/R+Gas6組):于缺氧前15 min在無血清低糖培養(yǎng)基中加入終濃度為100 μg/L的重組人 Gas6，構(gòu)建模型;缺氧/復(fù)氧 +Gas6+PI3K/Akt特異性阻斷劑LY294002組(A/R+Gas6+LY294002組):缺氧前30 min在無血清低糖培養(yǎng)基中避光加入10 μmol/L LY294002，余后處理同A/R+Gas6組。

2.4 MTT法測定H9c2細(xì)胞活力 將細(xì)胞密度分別調(diào)至1×107cells/L，取 200 μL/well接種于 96孔培養(yǎng)板中，2－3 d后隨機(jī)分組對(duì)應(yīng)處理后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，繼續(xù)正常培養(yǎng) 4 h 后，1000 r/min離心5 min后棄上層培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 0.15 mL，振蕩10 min后，酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度(A)值(檢測波長為570 nm)。細(xì)胞活力=(對(duì)照組A值－實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%。

2.5 Caspase－3活性檢測 取處理過的各組6孔培養(yǎng)板，先將細(xì)胞培養(yǎng)液收集于離心管中，用0.25%的胰酶消化貼壁細(xì)胞，收集于對(duì)應(yīng)離心管中，4℃、1000 r/min離心5 min，用冰預(yù)冷的PBS洗滌1次，沉淀細(xì)胞中加入50 μL預(yù)冷裂解液，混勻冰浴裂解15 min，4 ℃、30000 r/min 離心5 min，取各組上清備用。在96孔板中各組每孔加入檢測緩沖液80 μL，再加入上述各組待測樣品上清10 μL，隨后加入Ac－DEVD －pNA 10 μL，37 ℃孵育過夜，用酶標(biāo)儀測定各組的A405值，樣品的A405扣除空白對(duì)照組A405，即為caspase－3催化產(chǎn)生pNA的A值。按照caspase－3活性檢測試劑盒說明書，測定并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出對(duì)應(yīng)酶活力單位。

2.6 Annexin V－FITC/PI雙標(biāo)法及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 取處理過的各組6孔培養(yǎng)板，先將可能含有漂浮凋亡細(xì)胞的各組培養(yǎng)液分別收集于流式管中，用0.25%的胰酶消化貼壁細(xì)胞，并收集于對(duì)應(yīng)的流式管中，4℃、1000 r/min離心5 min，用冰預(yù)冷的PBS洗滌2次，然后用200 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。加入5 μL Annexin V－FITC，避光室溫反應(yīng)15 min，再加入10 μL PI避光室溫反應(yīng)5 min或者4℃反應(yīng)30 min，加入250 μL PBS，立即上機(jī)檢測。經(jīng)流式細(xì)胞儀分析結(jié)果判斷:左下象限Q3顯示活細(xì)胞(FITC－/PI－);左上象限Q1顯示死亡細(xì)胞，即壞死細(xì)胞(FITC－/PI+);右上象限Q2顯示晚期凋亡細(xì)胞(FITC+/PI+);右下象限 Q4顯示早期凋亡細(xì)胞(FITC+/PI－)。凋亡率為 Q2+Q4。

2.7 Western blotting檢測p－Akt蛋白表達(dá)水平取6孔培養(yǎng)板中密度達(dá)1×107cells/L的H9c2細(xì)胞，以預(yù)冷的PBS洗滌后加入200 μL含Cocktail的裂解液(按1 mL 裂解液加 20 μL Cocktail，使用前 5 min配制)，Bradford法測定蛋白濃度，各孔上樣量為75 μg，10%SDS PAGE 膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、加兔抗鼠p－Akt蛋白Ⅰ抗(1∶1000稀釋)、4℃孵育過夜、辣根過氧化物酶山羊抗兔IgG孵育1 h，DAB化學(xué)顯色照相。用LabWork 3.0 UVP軟件分析照片中蛋白條帶積分吸光度值(integrated absorbance，IA=平均吸光度值×面積)，以靶蛋白IA值/β－actin IA值的比值反映靶蛋白相對(duì)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 H9c2細(xì)胞活力的比較

Gas6預(yù)處理的A/R+Gas6組，H9c2細(xì)胞活力明顯高于A/R組(P＜0.05);給予PI3K/Akt特異性阻斷劑LY294002后，與A/R+Gas6組和control組比較，細(xì)胞活力明顯下降(P＜0.05)，但其與A/R比較無顯著差異，見表1。

表1 各組H9c2細(xì)胞活力和caspase－3活性變化Table 1.Changes of cell viability and caspase－3 activity of H9c2 cells among the four groups(.n=6)

表1 各組H9c2細(xì)胞活力和caspase－3活性變化Table 1.Changes of cell viability and caspase－3 activity of H9c2 cells among the four groups(.n=6)

*P ＜0.05 vs control;△P＜0.05 vs A/R;#P ＜0.05 vs A/R+Gas6.

Control 91.0 ±4.0 3.02 ±0.44 A/R 43.2 ±3.5＊ 8.86 ±0.70＊A/R+Gas6 82.1 ±4.3△ 4.63 ±0.50△A/R+Gas6+LY29400250.5 ±1.2# 7.92 ±0.18#

2 Caspase－3活性檢測

A/R組與control組比較，caspase－3活性增加(P＜0.05);A/R+Gas6組較A/R組caspase－3活性明顯降低(P＜0.05);A/R+Gas6+LY294002組與A/R+Gas6組比較，caspase－3活性顯著增加(P＜0.05)，見表1。

3 各組細(xì)胞凋亡率的比較

圖1顯示，A/R+Gas6組和control組細(xì)胞凋亡率明顯低于A/R組(P＜0.05);經(jīng)LY294002預(yù)處理后，細(xì)胞凋亡率顯著增加(P＜0.05)，但與A/R組比較無顯著差異(P＞0.05)。

Figure 1.Flow cytometry showed the changes of cell apoptotic rate(%)among the four H9c2 cell groups.1:control group;2:A/R group;3:A/R+Gas6 group;4:A/R+Gas6+LY294002 group..n=6.★P＜0.05 vs 1;☆P＜0.05 vs 2;◆P＜0.05 vs 3.圖1 流式細(xì)胞儀檢測4組H9c2細(xì)胞凋亡率的變化

4 Western blotting檢測p－Akt蛋白表達(dá)水平

經(jīng)A/R及Gas6預(yù)處理的細(xì)胞組，p－Akt蛋白水平明顯高于其它各組(P＜0.05);而加入LY294002組的p－Akt蛋白水平明顯低于 A/R+Gas6組和 A/R組(P＜0.01，P＜0.05);A/R組與control組比較，p－Akt蛋白水平差異顯著(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Changes of expression of p－Akt protein among the four H9c2 cell groups.1:control group;2:A/R group;3:A/R+Gas6 group;4:A/R+Gas6+LY294002 group..n=6.▲P＜0.05 vs 1;△P＜0.05 vs 2;＊＊P＜0.01 vs 3.圖2 4組H9c2細(xì)胞p－Akt蛋白表達(dá)水平變化

討 論

PI3K是一個(gè)包括許多脂質(zhì)激酶的家族，它可被受體酪氨酸激酶的配體激活。當(dāng)細(xì)胞受到生長因子、胰島素等刺激后，對(duì)應(yīng)的受體被激活，進(jìn)一步磷酸化Akt的C末端Ser473殘基，從而Akt被完全激活，作用于多種底物，包括雙水楊酸雙酚 A酯、caspase－9、糖原合酶激酶3α/β、哺乳類雷帕霉素靶蛋白等來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存、增殖和代謝［2］。深低溫環(huán)境、他汀類藥物、胰島素等均可通過PI3K/Akt相關(guān)通路抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［8－10］。因此PI3K/Akt存活通路在心肌缺血再灌注損傷中起著重要的保護(hù)作用，是受體酪氨酸激酶介導(dǎo)的胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，

受體酪氨酸激酶亞家族成員Mer、Sky及Axl的共同配體－Gas6最早是在缺乏血漿培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種維生素K依賴性蛋白，其分子結(jié)構(gòu)包括氨基末端及羧基末端，前者能與磷脂和膜蛋白結(jié)合，后者則是與受體酪氨酸激酶亞家族成員(Mer、Sky及Axl)結(jié)合的區(qū)域。受體酪氨酸激酶亞家族成員之一的Axl在心腦血管組織中表達(dá)較高，參與組織或細(xì)胞內(nèi)多種病理生理的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［11，12］，近些年來其配體Gas6在心腦血管系統(tǒng)的作用也日益凸顯。

在小鼠大腦中，神經(jīng)元細(xì)胞上Axl與Gas6結(jié)合，導(dǎo)致其自身磷酸化，招募信號(hào)分子如:Grb2(growth factor receptor－bound protein 2)和PI3K的亞家族p85，并激活下游的生存途徑［13］。另外在少突膠質(zhì)細(xì)胞中，Gas6信號(hào)可以激活A(yù)xl和PI3K/Akt(磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B)存活途徑來抑制由生長因子缺乏和腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［14］，在成纖維細(xì)胞、血管平滑肌、血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程中也有此作用機(jī)制發(fā)生，活化的Akt通過磷酸化作用進(jìn)一步激活或抑制下游靶蛋白，通過抑制caspase－3活性，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖和分化等作用［4，15］，予以 P13K 抑制劑 LY294002 或渥曼青霉素預(yù)處理后，Gas6對(duì)上述細(xì)胞凋亡的抑制作用明顯減弱，顯示Gas6可以通過P13K/Akt通路實(shí)現(xiàn)抗細(xì)胞凋亡的作用，但給予MAPK/ERK通路特異性阻斷劑PD980590并不能減弱Gas6的抗細(xì)胞凋亡作用［14］。最近報(bào)道在糖剝奪培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞和缺血再灌注肝臟細(xì)胞中，Gas6能通過P13K/Akt存活通路減少細(xì)胞凋亡。同時(shí)在高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌凋亡過程中，Gas6則主要是通過激活MAPK/ERK信號(hào)通路起著抗細(xì)胞凋亡的作用［5］。這似乎說明在缺氧缺糖環(huán)境下P13K/Akt存活通路是Gas6發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的主要通路。所以我們推測在心肌缺氧復(fù)氧這一病理生理過程中，Gas6是否也能通過激活PI3K/Akt存活通路抑制心肌細(xì)胞凋亡。

因此，我們采用H9c2心肌細(xì)胞系，而不是原代乳鼠心肌細(xì)胞，排除了心肌成纖維細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。同時(shí)利用 PI3K/Akt通路特異性阻斷劑LY294002，觀察Gas6對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組比較，H9c2細(xì)胞缺氧復(fù)氧后，磷酸化 Akt蛋白水平明顯增高，驗(yàn)證了PI3K/Akt信號(hào)通路是心肌缺血再灌注損傷中經(jīng)典保護(hù)通路之一。而 Gas6預(yù)處理后，細(xì)胞凋亡率及caspase－3活性均較A/R組明顯降低，磷酸化Akt蛋白水平明顯增高，提示Gas6可以減少心肌細(xì)胞凋亡，并可能是通過活化磷酸化Akt蛋白以激活PI3K/Akt通路實(shí)現(xiàn)的。但預(yù)先加入PI3K/Akt通路特異性阻斷劑LY294002后，Gas6的細(xì)胞保護(hù)作用被抑制。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果又證實(shí)了我們的預(yù)測。

所以通過本研究我們得出結(jié)論:Gas6能提高磷酸化Akt蛋白表達(dá)水平，可能以此激活PI3K/Akt存活通路，減少心肌缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞凋亡，同時(shí)提示PI3K/Akt存活通路在Gas6保護(hù)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著至關(guān)重要的作用。但在心肌細(xì)胞中Gas6具體如何激活PI3K/Akt存活通路，及是否存在MAPK/ERK信號(hào)通路的交互作用有待一進(jìn)步研究。

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