廖錦華， 李健玲， 嚴彥念， 李雅蘭△， 胡冬華， 項明方， 黃 強， 莫世煌， 彭雪梅， 王小平

(1暨南大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510630;2深圳市第二人民醫(yī)院麻醉科，廣東 深圳 518035;3暨南大學附屬第二醫(yī)院麻醉科，廣東 深圳 518020)

#現(xiàn)工作單位:南昌大學附屬贛州醫(yī)院麻醉科

1960年，Jennings首次提出心肌缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)的概念，證實再灌注損傷會引起心肌超微結(jié)構(gòu)不可逆的壞死［1］。近年來，隨著溶栓療法、冠脈搭橋術、導管技術、經(jīng)皮冠狀動脈血管成形術和心臟外科體外循環(huán)的建立和推廣，研究藥物預處理減少心肌缺血再灌注損傷的機制有著重要的意義。繼發(fā)現(xiàn)麻醉性鎮(zhèn)痛藥的心肌保護作用后，鹵素類吸入麻醉藥氟烷、安氟醚、異氟醚、七氟醚和地氟醚均被證明具有心肌保護作用。

七氟醚(sevoflurane，Sevo)具有誘導迅速及蘇醒快而完全，血流動力學穩(wěn)定，與兒茶酚胺類藥合用不增加心律失常發(fā)生率的優(yōu)點，是目前使用最多的吸入麻醉藥［2］。近些年來對七氟醚預處理的心肌保護作用做了廣泛的研究，其中活性氧(reactive oxygen species，ROS)和一氧化氮(nitric oxide，NO)通過各種錯綜復雜的信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應與其它機制聯(lián)系起來，它們在七氟醚預處理心肌保護中的作用也備受爭議。

缺血再灌注時產(chǎn)生的大量ROS是缺血再灌注損傷的主要原因［3］。七氟醚預處理產(chǎn)生 ROS［4］，七氟醚是如何通過ROS的產(chǎn)生來抑制缺血再灌注時ROS的增加，以及NO與ROS的關系仍有待進一步研究。闡明這些事件的機制將為解釋以往研究出現(xiàn)不一致結(jié)果提供理論依據(jù)，并為七氟醚預處理心肌保護作用的臨床應用給予理論支持。

根據(jù)以上的研究結(jié)果，我們假設七氟醚預處理產(chǎn)生的ROS和NO刺激心臟產(chǎn)生了超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)和過氧化氫酶(catalase，CAT)，這些抗氧化酶抑制了缺血再灌注時ROS的產(chǎn)生。本研究利用ROS清除劑N-(2-巰基丙酰基)甘氨酸［N-(2-mercaptopropionyl)glycine，2-MPG］和一氧化氮合酶抑制劑Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester，LNAME)，觀察它們對七氟醚預處理時缺血再灌注心肌SOD、GPx和CAT產(chǎn)生的影響以及它們對七氟醚減輕心肌缺血再灌注損傷的影響，以驗證上述科學假說。

材料和方法

1 動物

SPF級雌性SD大鼠，體重(200±20)g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2008-0002;在自然晝夜周期和自主獲得食物與水條件下飼養(yǎng)。

2 實驗方案

見圖1，大鼠隨機分為8組。為了比較缺血再灌注前后 ROS、NO、SOD、GPx和 CAT的不同，其中的4組［groupⅠ(sham，n=5);groupⅡ (Sevo，n=5);groupⅢ (2-MPG+Sevo，n=5);groupⅣ (LNAME+Sevo，n=5)］不進行缺血再灌注，只對左冠狀動脈前降支穿線而不結(jié)扎。其它4組［groupⅤ(IRI，n=10);group Ⅵ (Sevo+IRI，n=10);group Ⅶ(2-MPG+Sevo+IRI，n=10);group Ⅷ (L-NAME+Sevo+IRI，n=10)］通過對左冠狀動脈前降支的結(jié)扎和放松進行30 min的缺血和120 min的再灌注處理。除sham組和IRI組只給予100%氧30 min外，其余各組都用100%氧作為載氣給予2%七氟醚預處理30 min;2-MPG(10 mg/kg)和L-NAME(100 mg/kg)用生理鹽水溶解稀釋至2 mL，在七氟醚預處理前5 min至七氟醚預處理后5 min從右股靜脈滴入，其它組則滴入同等容量的生理鹽水;在缺血前等待15 min作為2-MPG和L-NAME的洗脫時間。

Figure 1.Experimental protocol.圖1 實驗方案

3 動物模型的建立

3%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，以針狀電極插入兩上肢及左下肢皮下連續(xù)監(jiān)測標準Ⅱ?qū)?lián)心電圖。白熾燈照射保暖。頸部剃毛消毒后橫行切開皮膚約1 cm，逐層分離暴露氣管，正中第3、4氣管軟骨環(huán)間作一倒“T”切口，置入氣管導管，接呼吸機 PCV模式下人工呼吸(f 50次/分，I/E 1∶1.5，Plimit20 cmH2O)。

左側(cè)胸壁剃毛消毒后在胸骨左側(cè)3-4肋間行橫切口切開皮膚，用止血鉗鈍性分離各肌層并刺破胸膜，再用兩把止血鉗橫行夾住胸骨，在兩鉗之間剪斷胸骨，插入牽拉器撐開肋骨，剪開心包膜，暴露心臟，在前室間溝可見心大靜脈，以此為標志于左心耳下離根部2-3 mm用2×6帶線圓針6-0號醫(yī)用錦綸單絲線繞過動脈深面，在肺動脈圓錐旁溝出針，深約1 mm，寬約2 mm。將絲線兩端從一直徑2 mm聚乙烯(polyethylene，PE)管中間穿出備用。穩(wěn)定10 min后，將一棉簽棒插入PE管，拉緊絲線用棉簽棒將PE管向前推直至阻斷冠狀動脈血流。再灌注時將棉簽棒從PE管中拔出。

缺血成功后可見心電圖Ⅱ?qū)?lián)R波增寬，ST段抬高，心肌蒼白隨后變青紫，心室壁運動減弱，可見心律失常。再灌注成功的標志為抬高的ST段逐漸下降，局部反應性充血呈鮮紅色，有炎性水腫、滲出。

4 ROS的測定

ROS熒光探針 -二氫乙啶(dihydroethidium，DHE;Vigorous Biotechnology)，可自由透過活細胞膜進入細胞內(nèi)，并被細胞內(nèi)的ROS氧化，形成氧化乙啶;氧化乙啶摻入染色體DNA中，產(chǎn)生紅色熒光。根據(jù)活細胞中紅色熒光的產(chǎn)生，可以判斷細胞ROS含量的多少和變化。取左心室心肌組織0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm，放入液氮中速凍后貯存于-80℃冰箱備用。恒冷切片機預冷，冷凍頭溫度設為-20℃，箱內(nèi)溫度為-20℃。從-80℃冰箱中取出組織，放置于滴有OCT包埋劑的組織支承器上，溫度平衡后切片，厚度10 μm，將切片附貼于預先處理好的載玻片上。用磷酸鹽緩沖鹽水工作液(PBS，pH 7.4)將 DHE 稀釋至 10 μmol/L，取 50 μL 稀釋后的檢測液滴于組織上，37℃潮濕環(huán)境中避光孵育30 min。孵育結(jié)束后，用 PBS溶液清洗2次，每次5 min。熒光顯微鏡下選擇N21濾色鏡(激發(fā)波長480-535 nm，發(fā)射波長590-610 nm)觀察和拍攝細胞紅色發(fā)射圖像，ROS陽性細胞在整個核區(qū)被染成紅色。拍照后用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(Media-Cybernetics Inc)計算平均吸光度值(mean absorbance，MA)。

5 組織勻漿的制備

取左心室心肌組織0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm，放入液氮中速凍后貯存于-80℃冰箱備用。融解RIPA裂解液(Beyotime，China)，混勻，取適當量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入苯甲基磺酰氟(PMSF)，使 PMSF的最終濃度為 1 mmol/L。從-80℃冰箱中取出組織，在冰面上把組織剪切成細小的碎片，按照每20 mg組織加入200 μL裂解液的比例加入裂解液，用玻璃勻漿器在冰浴中勻漿6 min。充分裂解后，12000×g、4℃離心10 min，取上清。

6 NO含量的檢測

總NO檢測試劑盒(碧云天)采用硝酸鹽還原酶還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，然后通過經(jīng)典的Griess reagent檢測亞硝酸鹽，從而測定出總NO。NO本身極不穩(wěn)定，在細胞內(nèi)很快代謝為硝酸鹽和亞硝酸鹽，通過上述方法檢測出所有的硝酸鹽和亞硝酸鹽的量，就可以推算出總的NO含量。

7 SOD活性的檢測

總SOD活性檢測試劑盒(NBT法)(碧云天)。通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子，將氮藍四唑還原為藍色的甲臜，后者在560 nm處有強吸收。而SOD可清除超氧陰離子，從而抑制了甲臜的形成。據(jù)此通過比色分析就可以計算出SOD活性水平。

8 GPx活性的測定

總GPx檢測試劑盒(碧云天)可以定量檢測出最常見的含硒的GPx和少量不含硒的GPx的總量。GPx可以催化GSH產(chǎn)生GSSG，而谷胱甘肽還原酶可以利用 NADPH催化 GSSG產(chǎn)生 GSH，通過檢測NADPH的減少量計算出GPx的活性。

6.5m～6.8m標高親水平臺受風浪侵蝕概率大，同時該平臺作為親水步道，要求護坡結(jié)構(gòu)耐久性好，且平整度高。因此，采用耐久性好，強度高、美觀性優(yōu)、厚度大的砌條石護坡。

9 CAT活性的檢測

CAT檢測試劑盒(碧云天)。在過氧化氫相對比較充足的情況下，CAT可以催化過氧化氫產(chǎn)生水和氧氣。殘余的過氧化氫在過氧化物酶的催化下可以氧化生色底物，產(chǎn)生紅色的產(chǎn)物N-(4-antipyryl)-3-chloro-5-sulfonate-pbenzoquinonemonoimine，最大吸收波長為520 nm。用過氧化氫標準品，制作標準曲線，計算出樣品中的CAT在單位時間單位體積內(nèi)催化了多少量的過氧化氫轉(zhuǎn)變?yōu)樗脱鯕?，從而計算出樣品中CAT的活性。

10 心肌缺血面積與梗死面積的確定

使用2，3，5- 氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色來確定心肌梗死面積。再灌注結(jié)束后再次阻斷冠狀動脈血流，從左心房注入0.2%伊文斯藍(Evans blue，EB)2 mL進行心肌染色，以區(qū)分缺血和非缺血組織。迅速取出心臟，去除非心臟組織、左右心耳，冷生理鹽水將殘血洗凈，用濾紙吸去水分后置于-20℃冷凍10 min。然后垂直于心臟長軸將其切成1.5 mm厚的薄片，可見有藍色區(qū)域和淡紅色區(qū)域，藍色區(qū)域為有血液灌注區(qū)，淡紅色區(qū)域為缺血區(qū)(area at risk，AAR)，拍照片后浸入1%TTC磷酸緩沖液中(pH 7.4)，37℃孵育20 min，可見白色的梗死區(qū)(ischemia，IS)和磚紅色未梗死區(qū)。然后用10%福爾馬林固定24 h，拍照，通過計算機圖像分析軟件Photoshop CS3(Adobe)計算AAR占左室面積(left ventricle，LV)的百分率(AAR/LV%)，IS占AAR的百分率(IS/AAR%)以及IS占LV的百分率(IS/LV%)。

11 心肌細胞凋亡的測定

使用一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天)。取缺血區(qū)心肌組織0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm，放入液氮中速凍后貯存于-80℃冰箱備用。恒冷切片機預冷，冷凍頭溫度設為-20℃，箱內(nèi)溫度為-20℃，從-80℃冰箱中取出組織，放置于滴有OCT包埋劑的組織支承器上，溫度平衡后切片，厚度5 μm，將切片附貼于預先處理好的載玻片上。用4%多聚甲醛固定組織30min，PBS洗滌2次，每次15 min，加入含0.1%Triton X-100的PBS，冰浴孵育2 min，用PBS洗滌2次。在樣品上加50 μL TUNEL檢測液，濕盒中37℃避光孵育60 min。PBS洗滌3次。用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下選擇GFP濾色鏡觀察。激發(fā)波長范圍為450-500 nm，發(fā)射波長范圍為515-565 nm(綠色熒光)。每個心肌標本隨機取3個缺血區(qū)組織。正常心肌細胞核無熒光，凋亡心肌細胞核可見綠色熒光。每張切片隨機選取10個視野(10×20倍)，拍照，對凋亡陽性細胞進行計算機圖像計數(shù)和分析，計算凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)，然后計算凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)(%)=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。設陰性對照和陽性對照。

12 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 ROS含量

見圖2，與假手術對照組相比，在缺血再灌注前，七氟醚預處理增加ROS(12.0±0.8 vs 2.6±0.5，P＜0.05)，2-MPG減少七氟醚預處理引起的ROS升高(5.1±0.7 vs 12.0±0.8，P＜0.05)，L-NAME也減少七氟醚預處理引起的ROS升高(9.5±0.5 vs 12.0±0.8，P＜0.05)，但高于2-MPG處理組(9.5±0.5 vs 5.1±0.7，P＜0.05);在缺血再灌注后，七氟醚預處理組升至16.2±0.9，低于IRI組的24.9±1.3(P ＜0.05)，2-MPG+Sevo+IRI組與 IRI組比較無顯著差異 (24.9±1.4 vs 24.9±1.3，P＞0.05)，L-NAME+Sevo+IRI組比IRI組低 (19.6±1.2 vs 24.9±1.3，P＜0.05)。

2 心肌NO含量

見圖3，與對照組比較，七氟醚預處理增加NO含量(34.5±3.2 vs 15.9±1.4，P ＜0.05)，使用2-MPG后NO含量與對照組比較無顯著差別(P＞0.05)，一氧化氮合酶抑制劑也抑制NO含量升高(15.6±1.3 vs 15.9±1.4，P＞0.05)。

3 心肌SOD活性

見圖4，與對照組比較，七氟醚預處理增加SOD活性 (1.5±0.5 vs 0.6±0.2，P＜0.05)，2-MPG 消除了七氟醚預處理引起的SOD活性增加，L-NAME沒有這個作用(1.1±0.1 vs 1.5±0.5，P ＞0.05);在缺血再灌注后SOD活性Sevo+IRI組高于IRI組(0.5±0.1 vs 0.1 ±0.1，P ＜0.05)，2-MPG+Sevo++IRI組與IRI組無顯著差異(0.2±0.1 vs 0.1±0.1，P＞0.05)，L-NAME+Sevo+IRI組與 Sevo+IRI組無顯著差異(0.3±0.1 vs 0.5±0.1，P＞0.05)。

4 心肌GPx活性

Figure 2.Effect of Sevo on ROS production(DHE fluorescence，×200).圖2 Sevo對ROS的影響

Figure 3.Effect of Sevo on the concentration of NO in myocardium..n=5.*P＜0.05 vs sham.圖3 Sevo對心肌NO含量的影響

見圖5，七氟醚預處理使GPx活性從對照組的12.7±2.2增至22.8±2.5(P＜0.05)，2-MPG減少GPx的增加 (P＞0.05)，L-NAME部分減少GPx的增加，高于對照組(18.0±1.1 vs 12.7±2.2，P＜0.05)而低于Sevo組(18.0±1.1 vs 22.8±2.5，P＜0.05);在缺血再灌注后，Sevo+IRI組高于 IRI組(6.6±0.9vs3.1±0.6，P ＜0.05)，與IRI組比較，2-MPG減少GPx的增加但仍高于IRI組 (4.4±0.3 vs 3.1 ±0.6，P ＜0.05)，在 L-NAME+Sevo+IRI組與Sevo+IRI組GPx活性無顯著差異(5.6±

Figure 4.Effect of Sevo on the activity of SOD..n=5.*P＜0.05 vs sham;△P ＜0.05 vs IRI.圖4 Sevo對SOD活性的影響

Figure 5.Effect of Sevo on the activity of GPx..n=5.*P＜0.05 vs sham;△P ＜0.05 vs Sevo;▲P ＜0.05 vs IRI.圖5 Sevo對GPx活性的影響0.4 vs 6.6±0.9，P＞0.05)。

5 心肌CAT活性

見圖6，七氟醚預處理使CAT活性從對照組的11.2±1.4增至 15.5±1.8(P＜0.05)，2-MPG 減少缺血再灌注前CAT活性的增加(P＞0.05)，LNAME不能抑制 GPx活性的增加 (13.6±1.0 vs 15.5±1.8，P＞0.05);在缺血再灌注后，Sevo+IRI組高于IRI組 (5.2±1.1 vs 1.1±0.4，P＜0.05);2-MPG減少缺血再灌注后CAT活性的增加(P＞0.05)，L-NAME部分抑制了七氟醚預處理誘導的GPx活性增加，高于IRI組 (3.2±0.8 vs 1.1±0.4，P＜0.05)而低于Sevo+IRI組(3.2±0.8 vs 5.2±1.1，P＜0.05)。

Figure 6.Effect of Sevo on the activity of CAT..n=5.*P＜0.05 vs sham;△P＜0.05 vs IRI;▲P ＜0.05 vs Sevo+IRI.圖6 Sevo對CAT活性的影響

6 心肌梗死面積

見圖7，七氟醚預處理使心肌梗死面積從IRI組的82.0±9.4減小至Sevo+IRI組的41.2±7.5(P＜0.05);2-MPG完全消除了七氟醚預處理的保護作用 (79.3±6.5 vs 82.0±9.4，P＞0.05);LNAME減弱了七氟醚預處理的保護作用，因為使用L-NAME后梗死面積大于Sevo+IRI組(58.1±8.0 vs 41.2±7.5，P＜0.05)而小于 IRI組(P＜0.05)。

7 心肌細胞凋亡

見圖8，與IRI組比較，七氟醚預處理使細胞凋亡指數(shù)從52.3±7.0降至12.1±2.4(P＜0.05);2-MPG完全阻斷了七氟醚預處理的保護作用(51.2±7.7 vs 52.3±7.0，P＞0.05);L-NAME 減弱了七氟醚預處理的保護作用，該組的細胞凋亡指數(shù)高于Sevo+IRI組 (12.1±2.4 vs 32.1±4.2，P＜0.05)而低于IRI組 (P＜0.05)。

討 論

我們的研究結(jié)果表明七氟醚預處理誘導ROS和NO的產(chǎn)生，由此增加心肌SOD、GPx和CAT的活性，從而減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。

在過去的幾十年，缺血再灌注損傷被廣泛的研究。研究對象包括心肌細胞，在體或利用Langendorff裝置制備的離體缺血再灌注損傷模型。因為在體研究更接近臨床應用的環(huán)境，所以我們的研究采用的是在體模型，實驗結(jié)果能更好地類推到臨床。大鼠的心臟側(cè)支循環(huán)少，更容易產(chǎn)生明顯的梗死。并且根據(jù)Philipp等［5］的實驗我們采用缺血30 min后再灌注120 min的方法制作心肌缺血再灌注損傷模型。

Figure 7.Effect of Sevo on the infarction size of IRI rat hearts..n=5.The upper and lower whiskers represent the 95%confidence intervals.*P ＜0.05 vs IRI;△P ＜0.05 vs Sevo+IRI.圖7 Sevo對心肌梗死面積的影響

七氟醚預處理的心肌保護作用雖然已被證實，但是保護的機制仍舊不清楚，許多研究都已經(jīng)表明它是一個包括啟動物、信號轉(zhuǎn)導中介物和效應物的復雜信號轉(zhuǎn)導過程。ROS和NO最有可能是啟動物［6］。因為七氟醚呈現(xiàn)高度脂溶性，可以通過細胞和線粒體膜，抑制線粒體電子傳遞鏈復合物Ⅰ-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化還原酶，引起電子漏和產(chǎn)生 ROS［7］。

Figure 8.Effect of Sevo on the apoptotic index of IRI rat myocardial cells..n=5.*P＜0.05 vs IRI;△P＜0.05 vs Sevo+IRI;▲P＜0.05 vs Sevo+IRI.圖8 Sevo對心肌細胞凋亡指數(shù)的影響

自由基是指單獨存在的，具有不配對電子的離子、原子、分子基團。自由基化學性質(zhì)活潑，為了追蹤自由基的產(chǎn)生必須使用電子捕獲劑，目前常用的有 2'，7'- 二氯二氫熒光素二乙酯(2'，7'-dichlorodihydrofluorescein，DCDHF)和二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)，它們被氧化后分別顯示綠色熒光和紅色熒光，DCDHF對過氧化氫和一氧化氮比較敏感，而DHE對超氧陰離子較敏感［8］。為了避免一氧化氮對檢查結(jié)果的影響，我們選擇了DHE。ROS被認為是有害的，但是許多的事實表明它的作用與量有關，具有明顯的劑量-效應關系:低劑量有信號轉(zhuǎn)導和促進細胞增殖的作用，中劑量可誘導細胞凋亡，高劑量具有細胞殺傷作用，當少量存在時可以作為一種信號分子，在細胞保護的信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮有利的作用［9］。缺血預處理之所以有細胞保護作用是因為能夠誘導產(chǎn)生腺苷、阿片肽和緩激肽，這些大分子細胞間信號分子是如何保護細胞免受長時間的缺血和再灌注損傷的機制已經(jīng)闡述得比較清楚，它們都產(chǎn)生2種物質(zhì):ROS和NO。七氟醚預處理可能與缺血預處理有共同的機制。我們的實驗表明ROS是七氟醚預處理心肌保護的啟動物，ROS可能通過激活蛋白激酶的方式轉(zhuǎn)導信號。有研究表明ROS可以修飾蛋白激酶 C(PKC)的鋅指模體［10］，使 PKC轉(zhuǎn)位到細胞膜［11］，PKC轉(zhuǎn)位后開放線粒體 ATP敏感性鉀通道(mKATP)。開放mKATP已被證實是某些藥物預處理細胞保護的作用機制［12］。PKC的另一個作用是延遲線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitoPTP)的開放［13］。mitoPTP開放后位于線粒體基膜上的細胞色素C釋放至胞漿，細胞色素C可以介導細胞死亡。七氟醚預處理引起的抗氧化酶系統(tǒng)的激活是否與這些信號轉(zhuǎn)導通路有關目前不清楚。

在我們的研究中，七氟醚預處理沒有直接誘導NO的產(chǎn)生，因為當使用ROS清除劑2-MPG后沒有看到有NO的升高，這就意味著ROS位于NO的上游，是ROS誘導了NO的產(chǎn)生。NO是一氧化氮合酶(NOS)以L-精氨酸和分子氧為底物生成。NOS分為組成型一氧化氮合酶(cNOS)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)。ROS誘導NO合成的信號通路已經(jīng)被證實。七氟醚預處理可以通過ROS-AMPK信號轉(zhuǎn)導通路激活一氧化氮合酶(NOS)［4］。也有研究表明ROS激活了轉(zhuǎn)錄因子如激活子蛋白-1(AP-1)、核因子-κB(NF-κB)，這些因子使NOS mRNA的轉(zhuǎn)錄增加，也使NO產(chǎn)生增加。在我們的實驗中，七氟醚預處理使心肌NO升高的原因很可能與這些信號通路有關。NO的保護作用也是通過復雜的信號級聯(lián)反應產(chǎn)生的。有證據(jù)表明NO參與了缺血預處理的細胞保護作用。缺血預處理產(chǎn)生的緩激肽激活B2受體導致Ca2+的內(nèi)流，Ca2+的內(nèi)流激活了NOS而產(chǎn)生NO。NO通過一氧化氮-可溶性鳥苷酸環(huán)化酶-蛋白激酶G(NO-sGC-PKG)信號通路開放mKATP。開放mKATP具有細胞保護作用［14］。NO也可以通過sGC-PKG-MAPK/ERK1/2信號轉(zhuǎn)導通路產(chǎn)生細胞保護作用，該通路誘導硫氧化還原蛋白(thioredoxin，Trx)產(chǎn)生。Trx可以抑制ROS的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)氧化還原因子-1(Ref-1)、AP-1等轉(zhuǎn)錄因子的氧化還原狀態(tài)，激活環(huán)磷酸腺苷反應元件結(jié)合蛋白(CREB)，誘導Bcl-2和 Mn-SOD的表達［15］。GPx和 CAT是否也是通過這條信號通路仍然不清楚。有實驗表明使用硝酰比使用NO的保護作用更有效［16］，原因有可能是因為硝酰能夠同時產(chǎn)生ROS和NO，這同時也說明ROS和NO通過不同的途徑參與細胞保護。NO作為ROS的下游參與七氟醚預處理的心肌保護作用，因為NOS抑制劑減弱了七氟醚的保護作用。

以往的研究主要集中在七氟醚預處理對信號轉(zhuǎn)導通路的激活上，而且由于信號轉(zhuǎn)導通路的復雜性以及各信號通路之間存在“串話”現(xiàn)象，各個研究產(chǎn)生了不同的結(jié)果甚至是相互矛盾的。雖然如此，對于這些信號通路最終通過什么效應保護細胞，特別是七氟醚如何抑制缺血再灌注時ROS的產(chǎn)生研究甚少。我們的研究表明，誘導抗氧化酶產(chǎn)生有可能是七氟醚預處理心肌保護作用的效應物，因為當使用自由基清除劑2-MPG后沒有看到抗氧化酶的升高并且保護作用消失。七氟醚預處理是否激活了心肌抗氧化酶系統(tǒng)的研究并不多見，七氟醚肝損害的研究表明ROS是七氟醚肝損害的原因，同時七氟醚預處理明顯增加肝細胞內(nèi) SOD、GPx和 CAT的活性［17］。在我們的研究中，正是SOD、GPx和CAT活性的增加保護心肌免受缺血再灌注的損傷。七氟醚誘導產(chǎn)生的ROS不足以對心肌細胞產(chǎn)生損傷。相反，它作為一種信號分子使心肌產(chǎn)生預適應。有關心衰心肌的研究表明，心肌內(nèi)SOD、GPx和CAT的活性與 ROS 呈正相關［18］。

本研究不僅解決了七氟醚預處理誘導產(chǎn)生ROS和NO與抑制ROS對心肌保護作用的機制的理論問題，同時也提供了器官保護的新途徑，那就是可以使用那些誘導產(chǎn)生SOD、GPx和CAT的物質(zhì)用于器官保護。但是我們的實驗并沒有回答ROS和NO如何誘導SOD、GPx和CAT的產(chǎn)生。由于未進行血流動力學監(jiān)測，本實驗不能反映所做處理是否對血流動力學產(chǎn)生影響以及由此產(chǎn)生的對所檢測指標的影響。根據(jù)參考文獻［19］，我們在進行缺血再灌注前預留了15 min的藥物洗脫時間，這個時間是否能夠使藥物作用完全消失還有待進一步研究。

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