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        人肺組織體外感染模型的建立及NTHi誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的機(jī)制研究*

        2011-08-02 07:38:34夏靖燕程玉生王選錠
        中國病理生理雜志 2011年8期
        關(guān)鍵詞:磷酸化單抗抑制劑

        刁 然, 夏靖燕, 徐 峰△, 程玉生, 楊 燕, 王選錠

        (浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬二院1呼吸科,2腫瘤放療科3感染管理科,浙江 杭州 310009)

        大量研究證實不可分型流感嗜血桿菌(nontypeable Haemophilus influenzae,NTHi)是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)急性加重最重要的病原體[1]。肺部感染 NTHi后,導(dǎo)致中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞在氣道和肺實質(zhì)的聚集和炎癥細(xì)胞因子釋放,造成肺實質(zhì)損傷,甚至引起組織的破壞和重構(gòu),從而促進(jìn)COPD的發(fā)生發(fā)展。因此研究NTHi所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過程對COPD的防治具有重要意義。目前有關(guān)NTHi分子發(fā)病機(jī)制研究多采用小鼠模型或體外細(xì)胞模型。建立人肺組織體外感染模型來研究細(xì)菌與肺組織互相作用的細(xì)胞和分子機(jī)制,將更能反映人體內(nèi)的真實情況。本研究將利用人NTHi肺組織體外急性感染模型(acute NTHi infection model,AHIM)來闡明 Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)-p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)- 核因子 κB(nuclear factor κB,NF - κB)信號通路在介導(dǎo)細(xì)菌炎癥反應(yīng)中的作用。

        材料和方法

        1 主要材料

        NTHi為浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院檢驗中心的臨床分離株[1];羥乙基哌嗪乙磺酸-谷氨酸介導(dǎo)的具有保護(hù)作用的有機(jī)溶劑(HEPES-glutamic acid buffer- mediated organic solvent protection effect,HOPE)為德國Borstel研究中心贈送;RPMI-1640為Gibco產(chǎn)品;TLR2單抗購自Imgenex;GAPDH抗體購自eBioscience;SB203580(p38 MAPK抑制劑)購自Calbiochem;PDTC(NF-κB抑制劑)購自Sigma;電泳遷移率檢測(EMSA)試劑盒購自Pierce;酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自R&D。

        2 體外肺組織NTHi感染模型

        從5例因肺部孤立腫塊而接受胸科手術(shù)的成年患者的手術(shù)標(biāo)本中切取距腫塊5 cm外的正常肺組織。肺組織塊大小約1 cm×1 cm×1 cm。置于24孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)。每塊肺組織加入800 μL的RPMI-1640培養(yǎng)液。肺組織塊與1010CFU/L的NTHi置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱共孵育4 h和24 h后,組織塊置于HOPE溶液中4℃固定48 h。

        3 實時定量RT-PCR檢測TLR2 mRNA

        檢測肺組織TLR2 mRNA的表達(dá),取肺組織約50 mg,加入1 mL Trizol后置于組織勻漿器中碾成勻漿。勻漿移入無RNase的Eppendorff管。參照RNA抽提試劑盒說明操作。取RNA 2 μg,加oligo dT、逆轉(zhuǎn)錄酶等逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴(kuò)增TLR2和18S rRNA mRNA。TLR2引物序列:正義鏈5'-CCATTCCCCAGCGCTTT-3';反義鏈5'-CCGCTGAGCCTCGTCCAT-3';18SrRNA引物序列:正義鏈5'-TCAAGAACGAAAGTCGGAGG-3';反義鏈5'-GGACATCTAAGGGCATCACA -3'[2]。計算 2 組標(biāo)本間TLR2基因表達(dá)的相對差異:AHIM組/Medium組=2- ΔΔCp;ΔΔCp=(CpTLR2-AHIM- Cp18SrRNA-AHIM)-(CpTLR2-Medium-Cp18S rRNA-Medium)。

        4 Western blotting檢測AHIM中磷酸化p38 MAPK的表達(dá)

        取30 μg組織蛋白,經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜,脫脂奶粉封閉。Ⅰ抗為小鼠抗人TLR2抗體(1∶1500)或兔抗人磷酸化p38 MAPK抗體(1∶1000),Ⅱ抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶4000)或羊抗兔IgG(1∶4000),增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色。分別以GAPDH或p38 MAPK表達(dá)量作內(nèi)參照。

        5 電泳遷移率檢測(EMSA)檢測NF-κB

        嚴(yán)格按EMSA檢測試劑盒操作。取組織核蛋白5 μg上樣,NF-κB 的探針序列為:5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3',結(jié)合反應(yīng)檢測體系為:10 × binding buffer 2 μL,1 g/L poly(dI·dC)1 μL,50%glycerol 1 μL,NP -401 μL,100 mmol/L MgCl21 μL,biotin end - labeled target DNA 2 μL,ddH2O補足20 μL。非變性聚丙烯酰胺凝膠中100 V電泳80 min,100 V轉(zhuǎn)膜60 min,70℃固定1 h?;瘜W(xué)發(fā)光法檢測生物素標(biāo)記DNA。

        6 AHIM炎癥反應(yīng)的調(diào)控研究

        肺組織(1 cm×1 cm×1 cm)預(yù)先與抗TLR單抗(anti- TLR2∶5 mg/L)、MAPK 抑制劑(SB203580:20 μmol/L)或 NF - κB 抑制劑(PDTC:25 μmol/L)孵育2 h。然后加NTHi(1010CFU/L)刺激24 h,收集組織上清,置于-20℃,待測ELISA。

        7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-8

        采用雙抗夾心ELISA法測定,操作步驟見R&D公司說明。IL-8測定靈敏度為31.2 ng/L。

        8 統(tǒng)計學(xué)處理

        采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,行配對t檢驗或單因素方差分析(One-way ANOVA)。

        結(jié) 果

        1 AHIM中TLR2的表達(dá)

        肺組織感染NTHi 4 h和24 h后,TLR2 mRNA和蛋白表達(dá)都明顯上調(diào),見圖1。

        Figure 1.Enhanced expression of TLR2 mRNA(A)and protein(B)was found in lung tissues infected with NTHi 4 h and 24 h after stimulation..n=3-5.*P<0.05 vs medium group;△P <0.05 vs 0 h.圖1 NTHi刺激4 h和24 h后,肺組織TLR2表達(dá)明顯增加

        2 AHIM中磷酸化p38 MAPK蛋白的表達(dá)

        Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),NTHi刺激肺組織4 h,AHIM中磷酸化p38 MAPK蛋白表達(dá)較刺激前明顯增強(qiáng),見圖2。

        Figure 2.Elevated level of phosphorylation of p38 MAPK was detected in lung tissues infected with NTHi 4 h after stimulation..n=3.*P<0.05 vs 0 h.圖2 NTHi刺激4 h后AHIM中磷酸化p38 MAPK表達(dá)

        3 NTHi刺激后AHIM 的NF-κB活性檢測

        EMSA檢測發(fā)現(xiàn),NTHi刺激4 h,AHIM中NF-κB的DNA結(jié)合能力較對照組明顯增強(qiáng),見圖3。

        4 AHIM上清中的炎癥因子測定

        組織上清 IL-8檢測顯示,TLR2單抗、p38 MAPK和NF-κB抑制劑能顯著降低NTHi所誘導(dǎo)的肺組織炎癥反應(yīng),見圖4。結(jié)果提示:NTHi通過TLR2-p38MAPK-NF-κB通路來誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。

        Figure 3.NF-κB activation was detected by EMSA in lung tissues infected with NTHi 4 h after stimulation.Lane 1:control;Lane 2:NTHi stimulation.圖3 NTHi刺激4 h后EMSA法檢測AHIM中NF-κB的活性

        Figure 4.Effects of anti-TLR2,p38 MAPK and NF - κB inhibitors on NTHi-induced IL-8 production in lung tissues..n=5.*P<0.05 vs NTHi group.圖4 TLR2單抗、p38 MAPK和NF-κB抑制劑對NTHi誘導(dǎo)IL-8生成的影響

        討 論

        我們從因肺部孤立結(jié)節(jié)或腫塊而接受肺葉或全肺切除的手術(shù)標(biāo)本中切取腫塊遠(yuǎn)處的正常肺組織塊,體外與NTHi共孵育,建立AHIM。該模型可作為連接人體細(xì)胞和整體動物模型的橋梁,為在組織水平研究肺部疾病的病理生理變化提供一個功能平臺。利用AHIM和HOPE技術(shù)便于開展肺部感染性疾病發(fā)生早期不同橫斷面的組織、分子病理學(xué)研究[3,4]。并且AHIM模型較小鼠模型和體外細(xì)胞模型更接近機(jī)體內(nèi)的真實情況。

        近年來,利用小鼠基因敲除模型,TLR2受體被證實是NTHi的重要識別受體[1]。通過體外細(xì)胞感染實驗,研究者也發(fā)現(xiàn):NTHi感染可激活上皮細(xì)胞多條信號通路,啟動靶基因表達(dá),參與NTHi發(fā)病[5]。既往研究中,NF-κB和p38 MAPK被證實為介導(dǎo)NTHi誘發(fā)免疫反應(yīng)的重要信號分子[1]。有研究表明:阻斷p38 MAPK通路并不影響NF-κB/RelA的核轉(zhuǎn)位和向IL-8基因啟動子的聚集,但降低了IL-8啟動子處的p65/RelA的磷酸化水平,同時抑制了細(xì)菌誘導(dǎo)的RNA聚合酶Ⅱ向IL-8啟動子的募集[6]。這些結(jié)果顯示:p38 MAPK可以通過調(diào)節(jié)NF-κB p65介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活化,從而影響炎癥因子表達(dá)。

        利用AHIM模型,我們發(fā)現(xiàn)NTHi感染后,肺組織TLR2-p38 MAPK-NF-κB信號通路迅速被激活。用抗TLR2抗體或特異性MAPK和NF-κB分子阻斷劑可以顯著抑制NTHi所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。我們的研究在組織水平闡明NTHi主要通過TLR-2-p38 MAPK-NF-κB信號通路來誘導(dǎo)肺組織分泌炎癥因子。同時我們的工作再次證實,HOPE固定技術(shù)對肺組織的核酸和蛋白有很好的保護(hù)作用[4]。

        AHIM結(jié)合HOPE固定技術(shù),為研究病原菌與機(jī)體組織的相互作用提供了很好的研究平臺。進(jìn)一步深入了解NTHi促炎癥反應(yīng)的細(xì)胞和分子機(jī)制,有助于新的分子靶向性藥物的研發(fā)。

        [1]Xu F,Xu Z,Zhang R,et al.Nontypeable Haemophilus influenzae induces COX-2 and PGE2expression in lung epithelial cells via activation of p38 MAPK and NF-κB[J].Respir Res,2008,9:16.

        [2]Xu F,Droemann D,Rupp J,et al.Mo-dulation of the inflammatory response to Streptococcus pneumoniae in a model of acute human lung tissue infection[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2008,39(5):522 -529.

        [3]Olert J,Wiedorn KH,Goldmann T,el al.HOPE fixation:a novel fixing method and paraffin-embedding technique for human soft tissues [J].Pathot Res Pracl,2001,197(12):823-826.

        [4]夏靖燕,徐 峰,傅燕飚.介紹一種新的肺組織體外固定液[J].中華病理學(xué)雜志,2008,37(11):787-788.

        [5]Li JD.Exploitation of host epithelial signaling networks by respiratory bacterialpathogens [J]. J Pharmacol Sci,2003,91(1):1-7.

        [6]Schmeck B,Zahlten J,Moog K,et al.Streptococcus pneumonia-induced p38 MAPK-dependent phosphorylation of RelA at the interleukin-8 promotor[J].J Biol Chem,2004,279(51):53241-53247.

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