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        人肺組織體外感染模型的建立及NTHi誘導炎癥反應的機制研究*

        2011-08-02 07:38:34夏靖燕程玉生王選錠
        中國病理生理雜志 2011年8期
        關鍵詞:磷酸化單抗抑制劑

        刁 然, 夏靖燕, 徐 峰△, 程玉生, 楊 燕, 王選錠

        (浙江大學醫(yī)學院附屬二院1呼吸科,2腫瘤放療科3感染管理科,浙江 杭州 310009)

        大量研究證實不可分型流感嗜血桿菌(nontypeable Haemophilus influenzae,NTHi)是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)急性加重最重要的病原體[1]。肺部感染 NTHi后,導致中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞在氣道和肺實質的聚集和炎癥細胞因子釋放,造成肺實質損傷,甚至引起組織的破壞和重構,從而促進COPD的發(fā)生發(fā)展。因此研究NTHi所誘導的炎癥反應過程對COPD的防治具有重要意義。目前有關NTHi分子發(fā)病機制研究多采用小鼠模型或體外細胞模型。建立人肺組織體外感染模型來研究細菌與肺組織互相作用的細胞和分子機制,將更能反映人體內的真實情況。本研究將利用人NTHi肺組織體外急性感染模型(acute NTHi infection model,AHIM)來闡明 Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)-p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)- 核因子 κB(nuclear factor κB,NF - κB)信號通路在介導細菌炎癥反應中的作用。

        材料和方法

        1 主要材料

        NTHi為浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院檢驗中心的臨床分離株[1];羥乙基哌嗪乙磺酸-谷氨酸介導的具有保護作用的有機溶劑(HEPES-glutamic acid buffer- mediated organic solvent protection effect,HOPE)為德國Borstel研究中心贈送;RPMI-1640為Gibco產(chǎn)品;TLR2單抗購自Imgenex;GAPDH抗體購自eBioscience;SB203580(p38 MAPK抑制劑)購自Calbiochem;PDTC(NF-κB抑制劑)購自Sigma;電泳遷移率檢測(EMSA)試劑盒購自Pierce;酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自R&D。

        2 體外肺組織NTHi感染模型

        從5例因肺部孤立腫塊而接受胸科手術的成年患者的手術標本中切取距腫塊5 cm外的正常肺組織。肺組織塊大小約1 cm×1 cm×1 cm。置于24孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)。每塊肺組織加入800 μL的RPMI-1640培養(yǎng)液。肺組織塊與1010CFU/L的NTHi置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱共孵育4 h和24 h后,組織塊置于HOPE溶液中4℃固定48 h。

        3 實時定量RT-PCR檢測TLR2 mRNA

        檢測肺組織TLR2 mRNA的表達,取肺組織約50 mg,加入1 mL Trizol后置于組織勻漿器中碾成勻漿。勻漿移入無RNase的Eppendorff管。參照RNA抽提試劑盒說明操作。取RNA 2 μg,加oligo dT、逆轉錄酶等逆轉錄為cDNA。PCR擴增TLR2和18S rRNA mRNA。TLR2引物序列:正義鏈5'-CCATTCCCCAGCGCTTT-3';反義鏈5'-CCGCTGAGCCTCGTCCAT-3';18SrRNA引物序列:正義鏈5'-TCAAGAACGAAAGTCGGAGG-3';反義鏈5'-GGACATCTAAGGGCATCACA -3'[2]。計算 2 組標本間TLR2基因表達的相對差異:AHIM組/Medium組=2- ΔΔCp;ΔΔCp=(CpTLR2-AHIM- Cp18SrRNA-AHIM)-(CpTLR2-Medium-Cp18S rRNA-Medium)。

        4 Western blotting檢測AHIM中磷酸化p38 MAPK的表達

        取30 μg組織蛋白,經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電轉至硝酸纖維膜,脫脂奶粉封閉。Ⅰ抗為小鼠抗人TLR2抗體(1∶1500)或兔抗人磷酸化p38 MAPK抗體(1∶1000),Ⅱ抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(1∶4000)或羊抗兔IgG(1∶4000),增強化學發(fā)光法顯色。分別以GAPDH或p38 MAPK表達量作內參照。

        5 電泳遷移率檢測(EMSA)檢測NF-κB

        嚴格按EMSA檢測試劑盒操作。取組織核蛋白5 μg上樣,NF-κB 的探針序列為:5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3',結合反應檢測體系為:10 × binding buffer 2 μL,1 g/L poly(dI·dC)1 μL,50%glycerol 1 μL,NP -401 μL,100 mmol/L MgCl21 μL,biotin end - labeled target DNA 2 μL,ddH2O補足20 μL。非變性聚丙烯酰胺凝膠中100 V電泳80 min,100 V轉膜60 min,70℃固定1 h?;瘜W發(fā)光法檢測生物素標記DNA。

        6 AHIM炎癥反應的調控研究

        肺組織(1 cm×1 cm×1 cm)預先與抗TLR單抗(anti- TLR2∶5 mg/L)、MAPK 抑制劑(SB203580:20 μmol/L)或 NF - κB 抑制劑(PDTC:25 μmol/L)孵育2 h。然后加NTHi(1010CFU/L)刺激24 h,收集組織上清,置于-20℃,待測ELISA。

        7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-8

        采用雙抗夾心ELISA法測定,操作步驟見R&D公司說明。IL-8測定靈敏度為31.2 ng/L。

        8 統(tǒng)計學處理

        采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示,行配對t檢驗或單因素方差分析(One-way ANOVA)。

        結 果

        1 AHIM中TLR2的表達

        肺組織感染NTHi 4 h和24 h后,TLR2 mRNA和蛋白表達都明顯上調,見圖1。

        Figure 1.Enhanced expression of TLR2 mRNA(A)and protein(B)was found in lung tissues infected with NTHi 4 h and 24 h after stimulation..n=3-5.*P<0.05 vs medium group;△P <0.05 vs 0 h.圖1 NTHi刺激4 h和24 h后,肺組織TLR2表達明顯增加

        2 AHIM中磷酸化p38 MAPK蛋白的表達

        Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),NTHi刺激肺組織4 h,AHIM中磷酸化p38 MAPK蛋白表達較刺激前明顯增強,見圖2。

        Figure 2.Elevated level of phosphorylation of p38 MAPK was detected in lung tissues infected with NTHi 4 h after stimulation..n=3.*P<0.05 vs 0 h.圖2 NTHi刺激4 h后AHIM中磷酸化p38 MAPK表達

        3 NTHi刺激后AHIM 的NF-κB活性檢測

        EMSA檢測發(fā)現(xiàn),NTHi刺激4 h,AHIM中NF-κB的DNA結合能力較對照組明顯增強,見圖3。

        4 AHIM上清中的炎癥因子測定

        組織上清 IL-8檢測顯示,TLR2單抗、p38 MAPK和NF-κB抑制劑能顯著降低NTHi所誘導的肺組織炎癥反應,見圖4。結果提示:NTHi通過TLR2-p38MAPK-NF-κB通路來誘導炎癥反應。

        Figure 3.NF-κB activation was detected by EMSA in lung tissues infected with NTHi 4 h after stimulation.Lane 1:control;Lane 2:NTHi stimulation.圖3 NTHi刺激4 h后EMSA法檢測AHIM中NF-κB的活性

        Figure 4.Effects of anti-TLR2,p38 MAPK and NF - κB inhibitors on NTHi-induced IL-8 production in lung tissues..n=5.*P<0.05 vs NTHi group.圖4 TLR2單抗、p38 MAPK和NF-κB抑制劑對NTHi誘導IL-8生成的影響

        討 論

        我們從因肺部孤立結節(jié)或腫塊而接受肺葉或全肺切除的手術標本中切取腫塊遠處的正常肺組織塊,體外與NTHi共孵育,建立AHIM。該模型可作為連接人體細胞和整體動物模型的橋梁,為在組織水平研究肺部疾病的病理生理變化提供一個功能平臺。利用AHIM和HOPE技術便于開展肺部感染性疾病發(fā)生早期不同橫斷面的組織、分子病理學研究[3,4]。并且AHIM模型較小鼠模型和體外細胞模型更接近機體內的真實情況。

        近年來,利用小鼠基因敲除模型,TLR2受體被證實是NTHi的重要識別受體[1]。通過體外細胞感染實驗,研究者也發(fā)現(xiàn):NTHi感染可激活上皮細胞多條信號通路,啟動靶基因表達,參與NTHi發(fā)?。?]。既往研究中,NF-κB和p38 MAPK被證實為介導NTHi誘發(fā)免疫反應的重要信號分子[1]。有研究表明:阻斷p38 MAPK通路并不影響NF-κB/RelA的核轉位和向IL-8基因啟動子的聚集,但降低了IL-8啟動子處的p65/RelA的磷酸化水平,同時抑制了細菌誘導的RNA聚合酶Ⅱ向IL-8啟動子的募集[6]。這些結果顯示:p38 MAPK可以通過調節(jié)NF-κB p65介導的轉錄活化,從而影響炎癥因子表達。

        利用AHIM模型,我們發(fā)現(xiàn)NTHi感染后,肺組織TLR2-p38 MAPK-NF-κB信號通路迅速被激活。用抗TLR2抗體或特異性MAPK和NF-κB分子阻斷劑可以顯著抑制NTHi所誘導的炎癥反應。我們的研究在組織水平闡明NTHi主要通過TLR-2-p38 MAPK-NF-κB信號通路來誘導肺組織分泌炎癥因子。同時我們的工作再次證實,HOPE固定技術對肺組織的核酸和蛋白有很好的保護作用[4]。

        AHIM結合HOPE固定技術,為研究病原菌與機體組織的相互作用提供了很好的研究平臺。進一步深入了解NTHi促炎癥反應的細胞和分子機制,有助于新的分子靶向性藥物的研發(fā)。

        [1]Xu F,Xu Z,Zhang R,et al.Nontypeable Haemophilus influenzae induces COX-2 and PGE2expression in lung epithelial cells via activation of p38 MAPK and NF-κB[J].Respir Res,2008,9:16.

        [2]Xu F,Droemann D,Rupp J,et al.Mo-dulation of the inflammatory response to Streptococcus pneumoniae in a model of acute human lung tissue infection[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2008,39(5):522 -529.

        [3]Olert J,Wiedorn KH,Goldmann T,el al.HOPE fixation:a novel fixing method and paraffin-embedding technique for human soft tissues [J].Pathot Res Pracl,2001,197(12):823-826.

        [4]夏靖燕,徐 峰,傅燕飚.介紹一種新的肺組織體外固定液[J].中華病理學雜志,2008,37(11):787-788.

        [5]Li JD.Exploitation of host epithelial signaling networks by respiratory bacterialpathogens [J]. J Pharmacol Sci,2003,91(1):1-7.

        [6]Schmeck B,Zahlten J,Moog K,et al.Streptococcus pneumonia-induced p38 MAPK-dependent phosphorylation of RelA at the interleukin-8 promotor[J].J Biol Chem,2004,279(51):53241-53247.

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