許呂宏， 方建培， 翁文駿， 徐宏貴

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院兒科，廣東 廣州 510120)

某些血液系統(tǒng)疾病如重型β－地中海貧血、再生障礙性貧血等均長期依賴輸血，造血干細(xì)胞移植是目前臨床上根治此類疾病的主要途徑［1］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)體器官移植或造血干細(xì)胞移植前不少患者由于多次接受同種異基因輸血而致敏，高敏患者發(fā)生移植排斥的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加［2］。然而造血干細(xì)胞移植與實(shí)體器官移植亦有所不同，輸注的造血干細(xì)胞循環(huán)于血液系統(tǒng)中，與致敏受者體內(nèi)的免疫細(xì)胞及抗體接觸的機(jī)會(huì)更多而更易被損傷。研究發(fā)現(xiàn)輸血致敏的主要因素之一是血液含異基因白細(xì)胞，本課題組既往通過異基因脾細(xì)胞輸注方法建立了致敏動(dòng)物模型［3］。本實(shí)驗(yàn)擬探討異基因骨髓細(xì)胞在致敏和非致敏受者的歸巢與植入情況，為開展促進(jìn)異基因造血干/祖細(xì)胞在致敏受者植入的策略研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

1 動(dòng)物及主要試劑

無特定病原體(SPF級(jí))的C57BL/6(H－2Db)及BALB/c(H－2Dd)小鼠，均為雄性，6－8周，體重18－20 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng)。羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(5，6－carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)購自 Invitrogen，RPMI－1640培養(yǎng)基購自Invitrogen，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的大鼠抗小鼠H－2Db購自PharMingen。

2 致敏模型與骨髓移植

參照文獻(xiàn)［3］建立致敏動(dòng)物模型，以C57BL/6小鼠脾細(xì)胞作為刺激源，BALB/c小鼠作為致敏受者。分離C57BL/6小鼠股骨及脛骨的骨髓，洗滌后用RPMI－1640培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)為5×1010/L，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力(＞99%)。部分骨髓細(xì)胞予熒光染料CFSE體外標(biāo)記進(jìn)行歸巢實(shí)驗(yàn)。供者骨髓細(xì)胞于照射后4 h經(jīng)尾靜脈注射0.2 mL(1×107)到致敏BALB/c小鼠;取正常BABL/c小鼠作為非致敏模型。移植的致敏及非致敏受者各25只，同時(shí)取單純照射未移植的BABL/c小鼠10只作為空白對(duì)照組。

3 供者細(xì)胞標(biāo)記及在受者體內(nèi)歸巢示蹤

3.1 CFSE標(biāo)記供者細(xì)胞 CFSE是一類透膜熒光染料，可用于標(biāo)記細(xì)胞漿內(nèi)的蛋白質(zhì)［4］。分離供者C57BL/6或BALB/c小鼠骨髓細(xì)胞后，以紅細(xì)胞裂解液溶解紅細(xì)胞，應(yīng)用PBS緩沖液將其濃度調(diào)整為(1－5)×1010/L，加入終濃度10 μmol/L 的 CFSE，置于37℃孵育10 min后，再與5倍體積含10%小牛血清的冷RPMI－1640完全培養(yǎng)液于－20℃孵育5 min以結(jié)束染色。應(yīng)用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，RPMI－1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，然后將細(xì)胞移植到受鼠體內(nèi)進(jìn)行示蹤檢查。染色后即時(shí)取少量細(xì)胞懸液，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光，激發(fā)光波長為488 nm。同時(shí)取部分染色后的細(xì)胞于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，應(yīng)用流式細(xì)胞儀及熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化。

3.2 供者細(xì)胞在移植受者各組織體內(nèi)歸巢示蹤于移植后第2 h、12 h及48 h處死移植受者，制備致敏模型的脾臟、股骨細(xì)胞懸液及眼靜脈血，以Tris－NH4Cl溶液溶解紅細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光的頻率(激發(fā)光波長為488 nm)。

4 供者細(xì)胞在受者體內(nèi)植入分析

4.1 生存分析 移植后每日觀察致敏模型的生存狀況，記錄死亡時(shí)間，繪制生存曲線。

4.2 外周血象及骨髓細(xì)胞恢復(fù) 移植后每周從致敏模型尾靜脈采血20 μL，并用KX－21血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Sysmex)檢測(cè)外周血白細(xì)胞、血紅蛋白及血小板等。同時(shí)每周分離致敏及非致敏受者的股骨，計(jì)數(shù)每根股骨中骨髓細(xì)胞的數(shù)量。

4.3 嵌合分析 移植后每周將受者骨髓細(xì)胞重懸于100 μL PBS緩沖液，加入1 μL FITC 標(biāo)記的大鼠抗小鼠H－2Db抗體，混勻后置于4℃冰箱內(nèi)避光孵育20 min。加入2 mL PBS緩沖液洗滌，1200 r/min離心5 min，棄上清后將細(xì)胞重懸于400 μL PBS緩沖液中，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，同時(shí)分別取BALB/c及C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞作陰性對(duì)照及陽性對(duì)照。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，應(yīng)用t檢驗(yàn)或單因素方差分析;繪制Kaplan－Meier生存曲線并進(jìn)行l(wèi)og－rank檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)α=0.05。

結(jié) 果

1 熒光染料CFSE標(biāo)記供者骨髓細(xì)胞

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用CFSE標(biāo)記C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果示標(biāo)記率為(99.25±0.33)%，將細(xì)胞于體外培養(yǎng)48 h后再次檢測(cè)其標(biāo)記率為(99.05±0.27)%，兩者差異無顯著(P＞0.05)。圖1顯示CFSE熒光染料標(biāo)記骨髓細(xì)胞48 h后在倒置顯微鏡下和綠色熒光顯微鏡下的情況，細(xì)胞仍保持很高的綠色熒光強(qiáng)度，說明CFSE適用于體內(nèi)動(dòng)態(tài)示蹤研究。

Figure 1.The photos of bone marrow cells labeled with CFSE at 48 h(×100).A:cells under inverted microscope;B:cells under fluorescence microscope.圖1 CFSE標(biāo)記骨髓細(xì)胞48 h在倒置顯微鏡和熒光顯微鏡下的情況

2 供者骨髓細(xì)胞在致敏模型的歸巢示蹤

移植后2 h、12 h、48 h取移植受者外周血、骨髓及脾臟制備單個(gè)細(xì)胞懸液，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)供者骨髓細(xì)胞(即CFSE+細(xì)胞)在各組織中的分布情況。結(jié)果如圖2所示，移植后第2 h，供者細(xì)胞在致敏受者體內(nèi)股骨及脾臟的分布與非致敏受者相比，差異無顯著(P＞0.05)，但供者細(xì)胞在非致敏受者外周血的分布是非致敏組的3倍，差異顯著(P＜0.01);移植后第12 h，供者細(xì)胞在非致敏受者外周血、股骨及脾臟的分布是致敏組的7.20倍(P＜0.01)、1.05倍(P＜0.05)和2.97倍(P＜0.01)，差異均顯著;移植后第48 h，供者細(xì)胞在非致敏受者外周血、股骨及脾臟的分布是致敏組的33.00倍、3.04倍和27.32倍，差異顯著(均P＜0.01)。

3 致敏模型接受移植后的生存分析

如圖3顯示各組動(dòng)物生存曲線，經(jīng)8 Gy［60Co］照射后的BALB/c小鼠，若單純照射而不予骨髓移植均在照射后10－16 d全部死亡，生存中位數(shù)為14 d。而照射后非致敏BALB/c小鼠經(jīng)尾靜脈移植1×107C57BL/6骨髓細(xì)胞后能全部存活。然而同樣經(jīng)8 Gy［60Co］照射預(yù)處理及尾靜脈移植1×107C57BL/6骨髓細(xì)胞，致敏組受者均于移植后2周左右全部死亡，生存中位數(shù)為13 d。Log－rank檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)致敏組與單純照射移植組的差異無顯著(P＞0.05);但致敏組與非致敏組差異顯著(P＜0.01)。

4 移植后受者外周血和骨髓細(xì)胞恢復(fù)情況與嵌合分析

Figure 2.Homing trace of CFSE+donor bone marrow cells in different tissues of recipients at different time points after transplantation.A:2 h after transplantation;B:12h after transplantation;C:48 h after transplantation.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs non － sensitized recipients.圖2 移植后不同時(shí)點(diǎn)CFSE+供者骨髓細(xì)胞在受者體內(nèi)不同組織的歸巢示蹤

Figure 3.Survival curves of recipients under irradiation with/without transplantation.圖3 單純照射及照射移植后受者的生存曲線

非致敏組受者予C57BL/6供者的骨髓細(xì)胞后其外周血象及股骨骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)隨時(shí)間推移而逐漸升高，而致敏組受者同樣予移植后其外周血象及股骨骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)隨時(shí)間推移均呈進(jìn)行性下降，并出現(xiàn)明顯的貧血、出血等征象。如表1所示，移植后第7 d及第14 d，致敏組外周血白細(xì)胞及股骨骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯低于非致敏組(P＜0.05)。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用正常BALB/c及C57BL/6小鼠股骨骨髓細(xì)胞作為陰性對(duì)照及陽性對(duì)照，檢測(cè)其H－2Db+細(xì)胞水平分別為(0.09±0.06)%和(99.78±0.20)%。骨髓移植后第7 d，取非致敏組與致敏組的骨髓細(xì)胞檢測(cè)H－2Db+細(xì)胞水平，結(jié)果分別為(48.07±4.70)%和(0.77±0.11)%，兩者差異顯著(P＜0.01)。移植后第14 d，H－2Db+細(xì)胞在非致敏組骨髓中百分比為(90.26±4.20)% ，說明供者細(xì)胞在非致敏受者體內(nèi)呈穩(wěn)定植入狀態(tài);而致敏組由于骨髓細(xì)胞過少，未能進(jìn)行H－2Db檢測(cè)。

表1 移植后受者白細(xì)胞、骨髓細(xì)胞恢復(fù)情況及嵌合分析Table 1.White blood cell(WBC)and bone marrow cells(BMCs)recovery and chimera analysis in recipients after transplantation(.n=5)

表1 移植后受者白細(xì)胞、骨髓細(xì)胞恢復(fù)情況及嵌合分析Table 1.White blood cell(WBC)and bone marrow cells(BMCs)recovery and chimera analysis in recipients after transplantation(.n=5)

＊＊P ＜0.01 vs non － sensitized recipients at the same time point.

BMCs(×106/Femur)Group WBC(×109/L)H－2Dbchimera(%)7 d 14 d 7 d 14 d 7 d 14 d Sensitized recipients 380 ±80＊＊ 320 ±80＊＊ 21 ±2＊＊ 6 ±2＊＊ 0.77 ±0.11＊＊Non－detection Non－sensitized recipients 1380±280 3240±300 396±27 596±32 48.07±4.70 90.26±4.20

討 論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用熒光染料CFSE標(biāo)記異基因供者骨髓細(xì)胞，結(jié)果顯示體外培養(yǎng)至48 h，細(xì)胞形態(tài)、熒光強(qiáng)度無明顯改變;同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果示標(biāo)記陽性率達(dá)99%。進(jìn)行體內(nèi)示蹤的移植受者無異常表現(xiàn)，說明CFSE有較好的標(biāo)記率和安全性。歸巢示蹤結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植后第2 h，供者細(xì)胞在致敏受者外周血的分布有所減少;移植后第12 h及48 h，供者細(xì)胞在致敏受者外周血、股骨及脾臟的分布均較非致敏組明顯減少，說明供者細(xì)胞在這些組織中被破壞。我們實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，供者骨髓細(xì)胞在非致敏受者股骨中的分布于移植后第48 h的分布比第12 h分布增加了1倍，說明供者骨髓細(xì)胞在受者體內(nèi)進(jìn)行增殖分化。而在致敏組中，供者骨髓細(xì)胞于移植后第48 h在受者股骨的分布反而比第12 h的分布還少，說明致敏受者骨髓微環(huán)境可能還影響異基因骨髓細(xì)胞的增殖與分化。植入分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)在非致敏組中，移植后受者能長期存活。移植后每周取外周血及骨髓細(xì)胞分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其外周血象及骨髓細(xì)胞的數(shù)量均隨時(shí)間推移而進(jìn)行性增加，嵌合體分析也進(jìn)一步證實(shí)異基因骨髓在非致敏受者體內(nèi)完全植入。而在致敏組中，致敏受者經(jīng)致死量照射后移植，2周左右全部死亡。血象及骨髓象均顯示隨時(shí)間推移而呈進(jìn)行性下降。嵌合體分析結(jié)果也說明致敏受者排斥異基因供者骨髓細(xì)胞。

有關(guān)異基因骨髓細(xì)胞在致敏模型中被排斥的機(jī)制尚未明確，一般認(rèn)為與受者體內(nèi)記憶性免疫細(xì)胞及預(yù)存的抗體有關(guān)，其中抗體介導(dǎo)的移植排斥占主要地位?？贵w可能通過多種機(jī)制損傷造血干細(xì)胞，如抗體能與異基因骨髓細(xì)胞MHC分子結(jié)合，通過補(bǔ)體依賴或抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用等途徑殺傷異基因骨髓細(xì)胞［5］。有研究表明此抗體的作用具有供者特異性，對(duì)無關(guān)供者或全相合骨髓細(xì)胞無殺傷作用［6］。另一方面，有研究認(rèn)為致敏受者血清可影響造血祖細(xì)胞的增殖與分化。臨床實(shí)驗(yàn)中，國外有學(xué)者將再障患者血清與骨髓細(xì)胞體外孵育培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能明顯抑制造血細(xì)胞集落的形成［7］。最近我們課題組檢測(cè)15份重型β地中海貧血患兒血清，發(fā)現(xiàn)患兒血清中群體反應(yīng)性抗體陽性標(biāo)本有6例，陽性檢出率為40%，抗體強(qiáng)度在14% －75%;分離臍血CD34+細(xì)胞作為造血干/祖細(xì)胞，通過體外集落培養(yǎng)也發(fā)現(xiàn)血清群體反應(yīng)性抗體能明顯抑制各種細(xì)胞集落形成［8，9］。

如何促進(jìn)異基因骨髓細(xì)胞在致敏受者體內(nèi)植入是目前研究的熱點(diǎn)。臨床治療高敏患者的措施有應(yīng)用免疫抑制劑、單克隆抗體、免疫吸附、血漿置換等［10］。最近Xu等［11］在致敏動(dòng)物模型的移植實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，增加預(yù)處理方案的強(qiáng)度能有效清除致敏免疫細(xì)胞，但不能防止致敏受者體內(nèi)抗體介導(dǎo)的移植排斥。他們研究還發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用免疫球蛋白、抗CD19及抗B220單抗等均不能提高異基因骨髓細(xì)胞在致敏模型的植入。最近我們應(yīng)用抗CD20單抗進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)能殺傷受者B細(xì)胞，降低致敏程度，但不能有效促進(jìn)異基因造血干細(xì)胞在致敏受者的植入［12］。本實(shí)驗(yàn)表明，異基因供者骨髓細(xì)胞在致敏受者體內(nèi)脾臟及股骨等部位被清除，產(chǎn)生移植排斥。進(jìn)一步探討致敏移植新策略將是未來的研究方向。

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