王福蘭，李福玲，王桂榮，劉素娟

(1濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濰坊 261031;2濰坊眼科醫(yī)院)

骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)具有多向分化潛能，來源豐富、取材簡便，可進行自體移植，被認為是帕金森病(PD)等神經(jīng)退行性疾病細胞替代療法的理想來源。2009年12月～2010年12月，我們采用香丹注射液誘導(dǎo)大鼠MSCs向多巴胺(DA)能神經(jīng)元分化，現(xiàn)分析結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料 6周齡SD(Sprague-Dawley)大鼠，雌雄不拘，體質(zhì)量150～180 g，由濰坊醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。Heraeus HERA Cell 150型CO2培養(yǎng)箱(德國)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus)，熒光顯微鏡(德國Leica公司)，重組大鼠堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、小鼠抗大鼠酪氨酸羥化酶(TH)均購自美國Sigma公司，香丹注射液購自河北天成藥業(yè)有限公司，小鼠抗大鼠微管相關(guān)蛋白2(MAP2)、小鼠抗大鼠增殖細胞核抗原(PCNA)、兔抗大鼠Bcl-2均購自武漢博士德生物公司，兔抗人神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、兔抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)均購自北京中杉生物技術(shù)公司。

1.2 MSCs誘導(dǎo)分化 參照文獻［1］，分離、純化和鑒定大鼠骨髓MSCs。取生長良好的第3代MSCs按1×105/ml密度接種于預(yù)先置有多聚賴氨酸處理過的蓋玻片的24孔培養(yǎng)板內(nèi)。待細胞生長達80%融合時分為誘導(dǎo)組及對照組。兩組均采用高糖培養(yǎng)基(L-DMEM)、10%FBS和25 ng/ml bFGF預(yù)誘導(dǎo)24 h，誘導(dǎo)組再予20%香丹注射液誘導(dǎo)3 h。

1.3 相關(guān)指標(biāo)檢測 誘導(dǎo)后細胞爬片冷丙酮固定10 min，3%H2O2-甲醇溶液孵育30 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，正常羊血清封閉，室溫，30 min，傾去多余血清，分別滴加 NSE(1∶100)、MAP2(1∶100)、GFAP(1∶100)、TH(1∶100)、PCNA(1∶100)、Bcl-2(1∶100)，4 ℃，過夜，滴加生物素化二抗，37℃，30 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素，37 ℃，30 min，DAB 避光顯色，5 ～10 min，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。各步驟間以0.01 mol/L PBS沖洗。PBS替代一抗作為陰性對照。光鏡下觀察誘導(dǎo)后MSCs的細胞形態(tài)。隨機選擇10個非重復(fù)視野(×100)，應(yīng)用免疫細胞化學(xué)方法分別計數(shù)NSE、MAP2、GFAP、TH、PCNA 和 Bcl-2陽性細胞數(shù)，陽性細胞率(%)=陽性細胞數(shù)/(陽性細胞數(shù)+陰性細胞數(shù))×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)以±s表示，采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

誘導(dǎo)組30 min后光鏡下少數(shù)MSCs發(fā)生形態(tài)變化，3 h后多數(shù)MSCs胞體收縮成錐形或球形，胞體折光性變強，細胞突起變細長，可見雙極細胞及多極細胞。兩組誘導(dǎo)后NSE、MAP2、GFAP、TH及PCNA、Bcl-2表達見表1。

3 討論

表1 兩組 NSE、MAP2、GFAP、TH 及 PCNA、Bcl-2 表達(%， ±s)

表1 兩組 NSE、MAP2、GFAP、TH 及 PCNA、Bcl-2 表達(%， ±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

組別NSE MAP2 GFAP TH PCNA Bcl-2誘導(dǎo)組 70.1 ±5.7* 60.5 ±4.9* 15.4 ±3.5* 17.2 ±7.1* 4.7 ±1.4*7.9 ±1.8對照組 14.2 ±2.1 1.4 ±0.5 4.5 ±1.2 3.6 ±2.2 30.7 ±4.3 10.2 ±2.6

多種誘導(dǎo)因素聯(lián)合應(yīng)用是體外誘導(dǎo)MSCs定向分化為DA能神經(jīng)元常用的手段之一。誘導(dǎo)因子bFGF不僅能提高MSCs的增殖速度和壽命，且能在增殖過程中保持其多分化潛能，并有誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化的作用［2］，還可以調(diào)節(jié)中腦DA神經(jīng)元的發(fā)育和分化［3］。

復(fù)方香丹注射液由丹參和降香的水蒸氣餾出液(成分為降香揮發(fā)油)組成，丹參具有活血化瘀作用，安全性好，實用價值高，是臨床治療心腦血管疾病的常用中藥，其水溶性成分主要為酚性酸類化合物，包括丹參素、原兒茶醛、丹酚酸A/B等，含量最高的兩個成分丹酚酸A和B活性最強，對脂質(zhì)過氧化引起的細胞膜損傷有明顯保護作用。降香揮發(fā)油主要作用為抗凝。本研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)分化后的MSCs細胞NSE、MAP2、TH均呈不同程度陽性表達，提示誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)元樣細胞已具備神經(jīng)元的抗原特性。PCNA由Miyachi等于1978年在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血清中首次發(fā)現(xiàn)并命名，因其只存在于正常增殖細胞及腫瘤細胞內(nèi)而得名，PCNA與細胞DNA合成關(guān)系密切，在細胞增殖的啟動上起重要作用，是反映細胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)。本實驗結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后大鼠MSCs的PCNA表達明顯減弱，表明細胞開始分化后其增殖力下降。為證實表達減弱是否因細胞凋亡所致，我們檢測了抗凋亡因子Bcl-2的表達，結(jié)果顯示誘導(dǎo)前后Bcl-2表達無明顯差異，證實誘導(dǎo)后的細胞分化開始、增殖減弱。

本研究結(jié)果提示香丹注射液能誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)元樣細胞分化，但確切機制尚不清楚，可能與丹酚酸降低神經(jīng)細胞缺氧損傷時的細胞死亡率，減少脂質(zhì)過氧化物生成有關(guān)。隨著研究的深入，體外神經(jīng)細胞分化途徑將越來越接近體內(nèi)神經(jīng)細胞發(fā)生，但獲得大量純化DA能神經(jīng)元的更有效誘導(dǎo)條件還有待于進一步探索。

［1］王曉萃，吳金生，付文玉，等.誘導(dǎo)大鼠間充質(zhì)干細胞形成的神經(jīng)元樣細胞的形態(tài)特征［J］.解剖學(xué)報，2007，38(1):107-110.

［2］Sun D，Bullock MR，McGinn MJ，et al.Basic fibroblast growth factor-enhanced neurogenesis contributes to cognitive recovery in rats following traumatic brain injury［J］.Exp Neurol，2009，216(1):56-65.

［3］Timmer M，Cesnulevicius K，Winkler C，et al.Fibroblast growth factor(FGF)-2 and FGF receptor 3 are required for the development of the substantia nigra，and FGF-2 plays a crucial role for the rescue of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine lesion［J］.J Neurosci，2007，27(3):459-471.

［4］Dinsmore J，Ratliff J，Jacoby D，et al.Embryonic stem cells as a model for studying regulation of cellular differentiation［J］.Theriogenology，1998，49(1):145-151.