傅榮，游曉波，魯峰

(1.四川省醫(yī)學(xué)院科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院整形外科，四川 成都 610072;2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院整形外科，廣東 廣州 510515)

種子細(xì)胞的獲取、培養(yǎng)與種植是組織工程學(xué)的關(guān)鍵性步驟，是其前提和基礎(chǔ)。一段時(shí)間以來(lái)，種子細(xì)胞來(lái)源不足、體外擴(kuò)增能力弱、細(xì)胞數(shù)量有限和功能老化等問(wèn)題限制了組織工程技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用。解決種子細(xì)胞問(wèn)題的關(guān)鍵就是如何獲得來(lái)源廣泛、數(shù)量充足、功能良好的細(xì)胞［1～3］。目前，干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，因其具有強(qiáng)大的自我更新、多向分化或跨胚層發(fā)育的可塑，在組織工程的構(gòu)建及基因的治療方面具有巨大發(fā)展?jié)摿Α６杉?xì)胞中的成體干細(xì)胞在應(yīng)用上與胚胎干細(xì)胞相比，不存在一些倫理學(xué)問(wèn)題，取材方便，對(duì)機(jī)體無(wú)害，由于誘導(dǎo)的組織不存在配型及免疫排斥問(wèn)題且分化的組織類(lèi)型廣泛，具有重要的臨床價(jià)值［4～6］。近年來(lái)的研究證實(shí)，脂肪組織中能分離和培養(yǎng)出脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞(adiposederived stem cells，ASCs)，可以向成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等不同胚層來(lái)源的細(xì)胞分化，具備自我更新能力與多向分化潛能，類(lèi)似于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等特性［7～9］，具有能大量獲得、自體取材容易、來(lái)源廣泛的優(yōu)勢(shì)，是一種較理想的組織工程種子細(xì)胞。脂肪組織一般通過(guò)脂肪吸脂術(shù)獲取，而抽吸物中包含脂質(zhì)和液體兩部分［10］，脂質(zhì)部分已被證實(shí)可以分離出具有多向分化能力的干細(xì)胞，而液態(tài)部分中是否也包含類(lèi)似的干細(xì)胞。我們已證實(shí)液態(tài)部分含有ASCs，并在細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、形態(tài)學(xué)、細(xì)胞衰老、表面標(biāo)志物和分化能力等方面與脂質(zhì)部分的干細(xì)胞具有非常相似的特性，認(rèn)為這種經(jīng)過(guò)最小限度人工干預(yù)的ASCs可能是將來(lái)脂肪組織工程比較理想的種子細(xì)胞［6］。2010年1～12月四川省醫(yī)學(xué)院科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院整形外科將脂肪抽吸術(shù)中獲得的脂質(zhì)成分作為脂肪干細(xì)胞的來(lái)源，進(jìn)行分離、培養(yǎng)、分化和鑒定等，為尋找一種理想的組織工程種子細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器 胎牛血清(PAA)高糖的DMEM、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰蛋白酶-EDTA、青鏈霉素原液，I型膠原酶(Sigma)，地塞米松(Sigma)，胰島素(Wako)，吲哚美辛(Sigma)，IBMX(Sigma)，油紅“O”，細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿，CD105、CD34、SMA和Ⅷ因子單克隆抗體(Zymed)，細(xì)胞免疫化學(xué)SPK檢測(cè)試劑盒(Zymed)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)孵箱(Forma)，超凈工作臺(tái)，低溫高速離心機(jī)，倒置顯微鏡，流式細(xì)胞儀。

1.2 組織材料 脂肪來(lái)自4例18～40歲行腹部及大腿脂肪抽脂術(shù)的健康成人，供體無(wú)傳染病及內(nèi)分泌疾病，男女比例為1∶1，平均脂肪抽吸物100 ml。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 人ASCs的體外分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性分析①脂肪組織采集及ASCs的分離:脂肪抽吸物被分為兩種成分:一種是比重小的脂質(zhì)成分，另一種是比重大的液體成分。本實(shí)驗(yàn)采集液體成分作為ASCs的來(lái)源。取得液體成分約300 ml，經(jīng)400 r/min低速離心5分鐘，去上清，取沉淀加入適量完全培養(yǎng)基制成混懸液，沉淀混懸后100 μm尼龍網(wǎng)過(guò)濾，細(xì)胞懸液用細(xì)胞記數(shù)板記數(shù)。②原代培養(yǎng):ASCs懸液接種于75 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)(5×104)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24小時(shí)、72小時(shí)各換液一次，去除非貼壁細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)純化ASCs，每3天換液一次。③ASCs傳代培養(yǎng):至細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，0.05%胰酶/0.02%EDTA消化傳代，10%FBS DMEM培養(yǎng)液中止細(xì)胞消化，400r離心5～10分鐘，10%FBS DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于三個(gè)75 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。④ASCs活力測(cè)定:取50 μl細(xì)胞重懸液與50 μl的0.2%臺(tái)盼藍(lán)染液混合，于血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)四個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)、死細(xì)胞數(shù)，計(jì)算活細(xì)胞的百分率［活細(xì)胞百分率=(活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%］。⑤ASCs的生長(zhǎng)及增殖特點(diǎn):細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)種中每日在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長(zhǎng)增殖狀況并拍照。采用離心法獲取ASCs，傳2代后，獲得均一的成纖維樣細(xì)胞，0.25%胰酶+0.02%EDTA消化，制成細(xì)胞懸液，接種至24孔培養(yǎng)板中(1×104細(xì)胞/孔)，每日取4孔細(xì)胞胰酶消化進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，剩余細(xì)胞，每3天換液1次，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果求平均數(shù)以繪制ASCs細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)體外培養(yǎng)細(xì)胞的分子表達(dá)四代細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)90%融合后，徹底清洗去除懸浮細(xì)胞后，胰酶消化，PBS重懸，每組取細(xì)胞2×106，行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分別檢測(cè)顯示ASCs特異性的CD44、CD29、CD106、CD34;成纖維細(xì)胞特異性的 HLA-DR;造血干細(xì)胞標(biāo)志的CD133、CD45進(jìn)行檢測(cè)的百分比。設(shè)空白對(duì)照(不加一抗和對(duì)應(yīng)二抗)和陰性對(duì)照(不加一抗，只加入二抗)。具體步驟:每組取培養(yǎng)細(xì)胞1×106，50%乙醇透化處理30分鐘，4℃ 1500 rpm離心10分鐘，棄上清，PBS洗滌，離心(同上)后制成100 μl單細(xì)胞懸液，各組分別加入鼠抗人 CD34、CD44、CD29、HLA-DR、CD133、CD106、CD45，室溫孵育 30 分鐘，PBS洗滌，離心，加入FITC標(biāo)一記的羊抗鼠二抗(1∶100)，4 ℃避光孵育30分鐘，PBS洗滌，離心，加PBS 至300 μl，制成細(xì)胞懸液，F(xiàn)CM 分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 把抽吸物液體部分直接離心、過(guò)濾，不經(jīng)過(guò)酶消化，在接種48小時(shí)內(nèi)ASCs是由大量圓形、透亮、無(wú)核的紅細(xì)胞所覆蓋，未見(jiàn)有梭形細(xì)胞貼壁。因?yàn)榧t細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，不貼壁的紅細(xì)胞在更換培養(yǎng)基時(shí)可除去。故經(jīng)過(guò)2～3次換液后，紅細(xì)胞逐漸減少直至最終消失，取而代之的是大量貼壁的梭形細(xì)胞(圖1a)。貼壁的細(xì)胞成纖維細(xì)胞樣的形態(tài)，在最初的5～7天有一段生長(zhǎng)延滯時(shí)間。然后細(xì)胞進(jìn)入增殖期，此后細(xì)胞增殖旺盛，原代培養(yǎng)的細(xì)胞8～12天即達(dá)70%～80%融合。單層細(xì)胞以0.25%胰蛋白酶消化傳代，以后每2～3天傳代一次。傳代后細(xì)胞形態(tài)主要為梭形(圖1b)，體外傳至10代后，細(xì)胞形態(tài)及倍增時(shí)間無(wú)明顯改變。

2.2 細(xì)胞活性 ASCs在倒置顯微鏡下觀察，均生長(zhǎng)良好，細(xì)胞透光性好，形態(tài)完整，細(xì)胞碎片少，細(xì)胞穩(wěn)定性好，可連續(xù)傳代。細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色，活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞被染成藍(lán)色，鏡下觀察，被染成藍(lán)色的細(xì)胞很少(圖 1c)。各組細(xì)胞在第 1、3、5、7、9 和11天的細(xì)胞存活率分別為(92.29±0.91)%、(92.83±1.26)%、(91.99±0.83)%、(92.93±0.81)%、(92.02±0.92)%和(91.98±0.93)%。

2.3 體外培養(yǎng)ASCs增殖速度 原代貼壁培養(yǎng)的ASCs生長(zhǎng)速度緩慢，細(xì)胞密度不均，培養(yǎng)約10～12天后細(xì)胞才能達(dá)到90%融合。傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞形態(tài)及密度均勻，數(shù)小時(shí)內(nèi)貼壁并伸展成多角形、梭形。2天前為相對(duì)抑制期，此后呈指數(shù)形式快速增殖，3～5天后達(dá)到80% ～90%融合。根據(jù)不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞數(shù)量繪制ASCs生長(zhǎng)曲線。

2.4 流式細(xì)胞儀鑒定 流式細(xì)胞儀測(cè)得ASCs表面標(biāo)記CD29、CD44陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明該細(xì)胞具有干細(xì)胞特性;HLA-DR幾乎無(wú)表達(dá)，排除該類(lèi)細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。ASCs細(xì)胞表面抗原分析:CD2974.0%，CD4436.9%，CD341.4%，HLA-DR 1.8%。

圖1 人脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞ASCs的分離培養(yǎng)，熒光標(biāo)記及多向分化 a：原代培養(yǎng)的ASCs b:熒光顯微鏡下GFP標(biāo)記的ASCs c：ASCs的體外成脂，成骨，成軟骨分化及鑒定

3 討論

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人們已成功分離培養(yǎng)了多種干細(xì)胞，這為人類(lèi)探索干細(xì)胞生物學(xué)調(diào)控機(jī)理和評(píng)價(jià)其治療人類(lèi)許多疾病的潛能打開(kāi)了方便之門(mén)。干細(xì)胞總體上可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞在理論上雖具有最理想的效果，但其自身的免疫原性、取材困難以及宗教倫理道德等問(wèn)題，限制了它在臨床上的應(yīng)用。而成體干細(xì)胞在分化能力上不及胚胎干細(xì)胞，但由于其可避免社會(huì)倫理之爭(zhēng)，逐漸成為研究的熱點(diǎn)。研究已證實(shí)從骨髓中分離得到的成體干細(xì)胞，在體外條件下可大量擴(kuò)增并表現(xiàn)出廣泛的多向分化潛能［11，12］。鑒于脂肪組織與骨髓同屬于中胚層組織，因此有學(xué)者認(rèn)為脂肪組織中也應(yīng)該含有類(lèi)似的干細(xì)胞，該假設(shè)被隨后一系列的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。

近年來(lái)，多個(gè)研究小組從脂肪組織中分離得到的抽脂處理細(xì)胞［13］、脂肪基質(zhì)微管碎片細(xì)胞、脂肪組織源基質(zhì)細(xì)胞、脂肪源中胚層干細(xì)胞、或者脂肪源間質(zhì)干細(xì)胞、脂肪源成體干細(xì)胞等［14～18］，這些細(xì)胞可能就是脂肪組織中的一類(lèi)多能性干細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兙憩F(xiàn)出具有體外可大量擴(kuò)增和多向分化的能力。目前，各國(guó)研究人員大多采用這種方法來(lái)分離和培養(yǎng)此種細(xì)胞并將所得的細(xì)胞稱(chēng)之為 ASCs［19，20］。

目前已證實(shí)ASCs能向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞及心肌細(xì)胞定向誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化，可作為多種組織工程的種子細(xì)胞。另外，ASCs目前已被用于研究骨缺陷、直腸陰道瘺的治療和軟組織增高術(shù)的臨床實(shí)驗(yàn)。由于ASCs具有易獲得性、可迅速擴(kuò)增及多向分化潛能等特點(diǎn)，其將成為具有廣闊治療應(yīng)用前景的一類(lèi)成體干細(xì)胞。

我們采用簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)方法，在未消化干細(xì)胞的條件下，從液體成分中成功獲得ASCs，效率較高，避免了紅細(xì)胞裂解液對(duì)細(xì)胞的損傷，同時(shí)避免了密度梯度離心法的操作復(fù)雜性。這種方法分離和培養(yǎng)出的細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖活性，體外培養(yǎng)可以保持在穩(wěn)定的群體倍增數(shù)增長(zhǎng)階段，且傳至10代以上增殖速度無(wú)明顯變化?？梢酝茰y(cè)，經(jīng)過(guò)最小限度人工干預(yù)的ASCs，其安全性和有效性將會(huì)更高，將更適合作為構(gòu)建組織工程脂肪的種子細(xì)胞來(lái)源。

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