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(1南京中醫(yī)藥大學(xué),南京 210029;2南京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

Janus激酶(JAK)是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶。JAK2是 JAK家族中受到高度關(guān)注的一員,其廣泛分布于體細(xì)胞的胞質(zhì)中,參與造血和免疫等系統(tǒng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。多項(xiàng)研究[1～5]證實(shí),真性紅細(xì)胞增多癥(PV)、原發(fā)性血小板增多癥(ET)、原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)等疾病中存在 JAK2激酶 V 617F點(diǎn)突變。該突變位點(diǎn)在 DNA序列的第 1 849位堿基,由胸腺嘧啶代替了原有的鳥嘌呤(G→T),導(dǎo)致編碼蛋白第 617位的苯丙氨酸被纈氨酸代替,引起該基因編碼的酪氨酸激酶活性增高。研究證實(shí)[6],JAK2 V617F是發(fā)生于干細(xì)胞水平的突變,是 PV、ET等骨髓增殖性腫瘤(MPN)的主要分子致病機(jī)制和診斷標(biāo)志。 2007年 11月～2010年 11月,本研究分析了 JAK2基因 V617F點(diǎn)突變?cè)?MPN患者中的發(fā)生情況,探討其在 MPN診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 臨床血液病送檢樣本 100例,男59例,女 41例,年齡 11～83歲。其中 PV(PV?)20例,有紅細(xì)胞增多但尚未明確診斷為 PV者 10例,ET(ET?)14例,有血小板增多但尚未明確診斷為ET者 13例,原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)9例,慢性髓性白血病(CML)2例,其他 MPN 6例,其他不明原因白細(xì)胞升高患者 8例;另有急性白血病(AML)1例,骨髓增生異常綜合征(MDS)10例,腔隙性梗死3例,慢性腎炎 1例,大 B細(xì)胞性淋巴瘤 1例,異體胎肝移植患者 1例,正常體檢者 1例。樣本中 91例為抗凝血,8例為石蠟包埋骨穿組織學(xué)檢測(cè)樣本,1例為骨穿送檢骨髓液。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 用 OMEGA bio-tek血液 DNA提取試劑盒及組織 DNA提取試劑盒,按照說明書操作。用 eppendorf核酸定量?jī)x選擇 dsDNA為測(cè)定目標(biāo)測(cè)定 DNA濃度,要求樣本 260 nm吸光率大于0.05,DNA濃度大于 2.0μg/μl。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 ①PCR引物:檢索 NCBIJAK2基因序列設(shè)計(jì)的第 12,14外顯子特異性引物兩對(duì),由上海生工公司合成。②PCR反應(yīng)體系:總體系 20 μl,PCR緩沖液,HotStarTaq DNA聚合酶 0.5 U,1×Q體系溶液,dNTP混合液 200μM,引物各 200 nM,模板 DNA 200～300 ng,雙蒸水 8.8μl。③PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 15 min,94℃變性 50 s,63℃～58℃退火 1min,72℃延伸 1 min,共循環(huán) 10次,94℃變性 50 s,57℃退火 1 m in,72℃延伸 1 min,共循環(huán) 30次,最后于 72℃延伸 10 min。每批次設(shè)置相應(yīng)對(duì)照和復(fù)管進(jìn)行質(zhì)控。

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化與測(cè)序 用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否為單一目的條帶。用 PCR清潔試劑盒對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行過柱純化,去除 dNTP、游離引物等。取適量 PCR純化產(chǎn)物,加ddH2O至 10 μl。使用 Bigdye Terminator v3.1 kit反應(yīng)體系進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序 PCR熱循環(huán)條件:96℃,10 s→(96℃ 10 s→50℃ 5 s→60℃ 4 min)×25個(gè)循環(huán)→60℃4min,4℃保溫。

1.2.4 測(cè)序產(chǎn)物純化與分析 采用酒精/EDTA/NaAc法[7]。溶解后的樣品于 95℃變性 4min,迅速置冰中冷卻 4 min后,上樣于 ABI-3100基因分析儀上進(jìn)行電泳。用測(cè)序分析軟件 SeqScapeV2.1.1進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較行 χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

經(jīng)直接測(cè)序法測(cè)定,100例樣本中,有 52例檢測(cè)了第 12,14兩個(gè)外顯子,48例僅檢測(cè)第 14外顯子。未發(fā)現(xiàn)第 12外顯子突變。V617F點(diǎn)突變情況見表 1。由表1可見,PV、ET、PMF、CML、其他 MPN、其他不明原因白細(xì)胞升高患者中均檢測(cè)到 V 617F點(diǎn)突變,非 MPN樣本中均未發(fā)現(xiàn) JAK2 V617F位點(diǎn)的突變,兩組相比,P＜0.01。此外,ET患者中檢出第 14內(nèi)含子 C/T突變 1例。

表1 100例樣本中 V 617F位點(diǎn)的突變情況(例)

3 討論

MPN是一類克隆性造血干細(xì)胞疾病,以骨髓中一系或一系以上髓系(如粒系,紅系,巨核系和肥大細(xì)胞系)增殖為特征。常伴有外周血粒系、紅系、巨核系和(或)肥大細(xì)胞系細(xì)胞數(shù)量不同程度增多,不伴有成熟分化障礙。其臨床表現(xiàn)具有異質(zhì)性,晚期則出現(xiàn)骨髓纖維化或轉(zhuǎn)為急性白血病。近年來多項(xiàng)研究[3,6～8]指出,JAK2 V617F位點(diǎn)突變可作為 MPN診斷中的重要分子遺傳學(xué)參考指標(biāo),該突變是BCR/ABL陰性 MPN的主要分子致病機(jī)制和診斷標(biāo)志。該突變發(fā)生于造血干/祖細(xì)胞階段,攜帶突變的造血干/祖細(xì)胞獲得生存優(yōu)勢(shì)而進(jìn)一步分化發(fā)育。一般臨床上利用外周血檢測(cè)該突變[3,6]。

本研究采用外周血有核細(xì)胞提取基因組 DNA,或直接用骨髓活檢樣本,使用直接測(cè)序法,對(duì) 100例樣本中 JAK2基因的第 12、14外顯子突變熱點(diǎn)區(qū)進(jìn)行了檢測(cè)。其中 JAK2基因第 12外顯子未檢測(cè)到突變,V617F及其他類型的突變總檢出率為 38.0%(38/100)。 PV、ET、PMF、CML、其他 MPN、其他不明原因白細(xì)胞升高患者中均檢測(cè)到 V617F點(diǎn)突變。且 PV患者中突變陽性率為 86.3%,ET患者中突變陽性率為 50%。而其他 AML、MDS及腔隙性梗死、慢性腎炎、大 B細(xì)胞性淋巴瘤、異體胎肝移植患者、正常體檢者等非 MPN患者中均未檢出 V617F的突變。這與國(guó)外研究[2,3,6]結(jié)果基本一致。再次證明JAK 2基因突變?cè)?MPN的發(fā)生率與其他血液惡性疾病相比有顯著性差異,JAK2 V617F位點(diǎn)突變可以作為診斷 MPN的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

此外,本研究中采用的直接測(cè)序法準(zhǔn)確率及重復(fù)性可以滿足臨床檢測(cè)的要求,對(duì)突變率的檢出也達(dá)到了較高水平,且具有穩(wěn)定、直觀及靈活的特點(diǎn),可以滿足臨床 MPN基因檢測(cè)的需要。進(jìn)一步研究 JAK2基因 V617F點(diǎn)突變?cè)?MPN發(fā)病中的作用,將有助于特定靶向藥物的研究[9],是 MPN治療的新方向。

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