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(1南京中醫(yī)藥大學,南京 210029;2南京中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院)

Janus激酶(JAK)是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶。JAK2是 JAK家族中受到高度關注的一員,其廣泛分布于體細胞的胞質中,參與造血和免疫等系統(tǒng)的信號轉導。多項研究[1～5]證實,真性紅細胞增多癥(PV)、原發(fā)性血小板增多癥(ET)、原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)等疾病中存在 JAK2激酶 V 617F點突變。該突變位點在 DNA序列的第 1 849位堿基,由胸腺嘧啶代替了原有的鳥嘌呤(G→T),導致編碼蛋白第 617位的苯丙氨酸被纈氨酸代替,引起該基因編碼的酪氨酸激酶活性增高。研究證實[6],JAK2 V617F是發(fā)生于干細胞水平的突變,是 PV、ET等骨髓增殖性腫瘤(MPN)的主要分子致病機制和診斷標志。 2007年 11月～2010年 11月,本研究分析了 JAK2基因 V617F點突變在 MPN患者中的發(fā)生情況,探討其在 MPN診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 臨床血液病送檢樣本 100例,男59例,女 41例,年齡 11～83歲。其中 PV(PV?)20例,有紅細胞增多但尚未明確診斷為 PV者 10例,ET(ET?)14例,有血小板增多但尚未明確診斷為ET者 13例,原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)9例,慢性髓性白血病(CML)2例,其他 MPN 6例,其他不明原因白細胞升高患者 8例;另有急性白血病(AML)1例,骨髓增生異常綜合征(MDS)10例,腔隙性梗死3例,慢性腎炎 1例,大 B細胞性淋巴瘤 1例,異體胎肝移植患者 1例,正常體檢者 1例。樣本中 91例為抗凝血,8例為石蠟包埋骨穿組織學檢測樣本,1例為骨穿送檢骨髓液。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 用 OMEGA bio-tek血液 DNA提取試劑盒及組織 DNA提取試劑盒,按照說明書操作。用 eppendorf核酸定量儀選擇 dsDNA為測定目標測定 DNA濃度,要求樣本 260 nm吸光率大于0.05,DNA濃度大于 2.0μg/μl。

1.2.2 PCR擴增 ①PCR引物:檢索 NCBIJAK2基因序列設計的第 12,14外顯子特異性引物兩對,由上海生工公司合成。②PCR反應體系:總體系 20 μl,PCR緩沖液,HotStarTaq DNA聚合酶 0.5 U,1×Q體系溶液,dNTP混合液 200μM,引物各 200 nM,模板 DNA 200～300 ng,雙蒸水 8.8μl。③PCR反應條件:95℃預變性 15 min,94℃變性 50 s,63℃～58℃退火 1min,72℃延伸 1 min,共循環(huán) 10次,94℃變性 50 s,57℃退火 1 m in,72℃延伸 1 min,共循環(huán) 30次,最后于 72℃延伸 10 min。每批次設置相應對照和復管進行質控。

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化與測序 用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察 PCR擴增產(chǎn)物是否為單一目的條帶。用 PCR清潔試劑盒對 PCR產(chǎn)物進行過柱純化,去除 dNTP、游離引物等。取適量 PCR純化產(chǎn)物,加ddH2O至 10 μl。使用 Bigdye Terminator v3.1 kit反應體系進行測序。測序 PCR熱循環(huán)條件:96℃,10 s→(96℃ 10 s→50℃ 5 s→60℃ 4 min)×25個循環(huán)→60℃4min,4℃保溫。

1.2.4 測序產(chǎn)物純化與分析 采用酒精/EDTA/NaAc法[7]。溶解后的樣品于 95℃變性 4min,迅速置冰中冷卻 4 min后,上樣于 ABI-3100基因分析儀上進行電泳。用測序分析軟件 SeqScapeV2.1.1進行結果分析。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件。組間比較行 χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

經(jīng)直接測序法測定,100例樣本中,有 52例檢測了第 12,14兩個外顯子,48例僅檢測第 14外顯子。未發(fā)現(xiàn)第 12外顯子突變。V617F點突變情況見表 1。由表1可見,PV、ET、PMF、CML、其他 MPN、其他不明原因白細胞升高患者中均檢測到 V 617F點突變,非 MPN樣本中均未發(fā)現(xiàn) JAK2 V617F位點的突變,兩組相比,P＜0.01。此外,ET患者中檢出第 14內(nèi)含子 C/T突變 1例。

表1 100例樣本中 V 617F位點的突變情況(例)

3 討論

MPN是一類克隆性造血干細胞疾病,以骨髓中一系或一系以上髓系(如粒系,紅系,巨核系和肥大細胞系)增殖為特征。常伴有外周血粒系、紅系、巨核系和(或)肥大細胞系細胞數(shù)量不同程度增多,不伴有成熟分化障礙。其臨床表現(xiàn)具有異質性,晚期則出現(xiàn)骨髓纖維化或轉為急性白血病。近年來多項研究[3,6～8]指出,JAK2 V617F位點突變可作為 MPN診斷中的重要分子遺傳學參考指標,該突變是BCR/ABL陰性 MPN的主要分子致病機制和診斷標志。該突變發(fā)生于造血干/祖細胞階段,攜帶突變的造血干/祖細胞獲得生存優(yōu)勢而進一步分化發(fā)育。一般臨床上利用外周血檢測該突變[3,6]。

本研究采用外周血有核細胞提取基因組 DNA,或直接用骨髓活檢樣本,使用直接測序法,對 100例樣本中 JAK2基因的第 12、14外顯子突變熱點區(qū)進行了檢測。其中 JAK2基因第 12外顯子未檢測到突變,V617F及其他類型的突變總檢出率為 38.0%(38/100)。 PV、ET、PMF、CML、其他 MPN、其他不明原因白細胞升高患者中均檢測到 V617F點突變。且 PV患者中突變陽性率為 86.3%,ET患者中突變陽性率為 50%。而其他 AML、MDS及腔隙性梗死、慢性腎炎、大 B細胞性淋巴瘤、異體胎肝移植患者、正常體檢者等非 MPN患者中均未檢出 V617F的突變。這與國外研究[2,3,6]結果基本一致。再次證明JAK 2基因突變在 MPN的發(fā)生率與其他血液惡性疾病相比有顯著性差異,JAK2 V617F位點突變可以作為診斷 MPN的一項重要指標。

此外,本研究中采用的直接測序法準確率及重復性可以滿足臨床檢測的要求,對突變率的檢出也達到了較高水平,且具有穩(wěn)定、直觀及靈活的特點,可以滿足臨床 MPN基因檢測的需要。進一步研究 JAK2基因 V617F點突變在 MPN發(fā)病中的作用,將有助于特定靶向藥物的研究[9],是 MPN治療的新方向。

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