任路平，宋光耀，章冬梅，孫 文，李 凡，陳樹春

(河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌一科，河北 石家莊 050051)

近年來(lái)，非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發(fā)病率逐漸增加，非酒精性脂肪肝與代謝綜合征關(guān)系密切［1］。大部分非酒精性脂肪肝病患者為單純性脂肪肝，也簡(jiǎn)稱為“脂肪肝”，膳食因素如脂類過(guò)量攝入與脂肪肝的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［2］。隨著含果糖的軟飲料如可樂、果汁等的攝入量逐年增加，果糖對(duì)機(jī)體糖脂代謝的影響也引起了人們的重視。既往研究表明慢性高果糖喂養(yǎng)后可誘導(dǎo)嚙齒類動(dòng)物發(fā)生肝內(nèi)脂質(zhì)沉積和胰島素抵抗［3］，但是關(guān)于短期高果糖過(guò)量攝入對(duì)肝臟脂質(zhì)沉積和肝胰島素敏感性的影響研究較少。本研究旨在通過(guò)高果糖飲食喂養(yǎng)小鼠3 d，觀察高果糖攝入對(duì)肝臟糖脂代謝的危害，并探討脂肪肝發(fā)生的早期機(jī)制及其與肝胰島素抵抗的關(guān)系。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 成年雄性C57BL/J6小鼠按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為對(duì)照(control)組及高果糖(HFru)組，20只/組，體重25～30 g。對(duì)照組進(jìn)食普通飼料;高果糖組果糖占總熱量34.5%(高果糖飼料配方參考文獻(xiàn)［4］，具體配方為:果糖34.5%，淀粉34.5%，脂肪9%，蛋白21%)。兩組每天進(jìn)食熱量基本相等，喂養(yǎng)3 d后行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定并處死小鼠，留取組織。

1.2 試劑 兔抗鼠乙酰輔酶A羧化酶(acetyl－CoA carboxylase，ACC)、硬脂酰輔酶 A脫飽和酶 －1(stearoyl－CoA desaturase 1，SCD －1)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p－Akt)和總蛋白激酶B(total protein kinase B，t－Akt)、磷酸化糖原合成激酶－3(phosphorylated glycogen synthase kinase 3，p－GSK －3α/β)和總糖原合成激酶 －3(total glycogen synthase kinase 3，t－ GSK －3α/β)抗體均由 Cell Signaling 提供(#3662、#2438、#9271、#9272、#9331和#7291)，兔抗鼠脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)抗體由 ABCAM公司提供(ab9686)，內(nèi)參照抗體pan 14－3－3由ABCAM提供(ab12341)。

2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.1 小鼠腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)(intraperitoneal glucose tolerance test，ipGTT) 各組小鼠喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)選取6只，過(guò)夜禁食12 h，后采尾血測(cè)定空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)(Roche血糖儀)，其后經(jīng)腹腔注射3 g/kg葡萄糖，于注射葡萄糖后30、60、90 min分別采尾血測(cè)定全血葡萄糖。通過(guò)0、30、60、90 min 各時(shí)點(diǎn)血糖值(FBG、BG30min、BG60min、BG90min)計(jì)算血糖曲線下面積(area under curve，AUC)，AUC=(FBG+BG30min)×30/2+(BG30min+BG60min)×30/2+(BG60min+BG90min)×30/2。以進(jìn)一步反映各組小鼠葡萄糖耐量。

2.2 肝臟病理變化檢查 取新鮮肝組織1塊(約10 mm×10 mm×2 mm)，置于10%中性甲醛液中固定，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，制成厚度為3 μm切片，行蘇木素－伊紅(HE)染色，中性樹膠封固。

2.3 肝臟甘油三酯(triglyceride，TG)測(cè)定 取肝臟組織30 mg經(jīng)氯仿/甲醇抽提甘油三酯后，加入0.6%NaCl分離水相和有機(jī)相，吸取有機(jī)相待干燥后溶于100%乙醇500 μL，應(yīng)用GPO－PAP試劑盒測(cè)定TG含量(Boehringer Mannheim)。

2.4 Western blotting方法檢測(cè)蛋白表達(dá) 于肝臟組織勻漿中加入10倍裂解液，13000 r/min離心15 min，BCA法測(cè)蛋白含量。取20 μg蛋白進(jìn)行10%聚丙烯凝膠電泳，濕法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入1∶1000稀釋的抗體，4℃搖床過(guò)夜，TTBS緩沖液洗膜后加入1∶10000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體，室溫孵育1 h，最后用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影。用ImageJ軟件分析，以目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參照pan 14－3－3的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。每組隨機(jī)選6例樣本進(jìn)行蛋白表達(dá)分析。

2.5 肝臟胰島素敏感性評(píng)估 于喂養(yǎng)3 d后每組隨機(jī)取12只小鼠，禁食10 h過(guò)夜，每組小鼠隨機(jī)選取6只小鼠注射生理鹽水，另向6只小鼠腹腔內(nèi)注射含有葡萄糖3 g/kg BW、胰島素2 U/kg的混合溶液，于注射后40 min處死小鼠，其后留取肝臟、肌肉和脂肪組織，凍存于－70℃。應(yīng)用Western blotting方法測(cè)定前述胰島素葡萄糖混合溶液注射后40 min小鼠肝臟組織的2個(gè)重要胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子Akt和GSK－3α/β總蛋白和磷酸化蛋白的表達(dá)。通過(guò)比較各組注射與未注射胰島素溶液的小鼠p－Akt/t－Akt和p－GSK－3α/β/t－GSK －3α/β 表達(dá)變化評(píng)估胰島素敏感性，比值減少代表肝細(xì)胞內(nèi)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白Akt和GSK－3α/β的磷酸化減少，提示肝臟胰島素敏感性下降。Western blotting檢測(cè)同方法2.4。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

在SPSS 11.0軟件上進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

結(jié) 果

1 喂養(yǎng)3 d后兩組小鼠各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

各組小鼠實(shí)驗(yàn)起始體重?zé)o差異，不同飼料喂養(yǎng)3 d后體重均無(wú)明顯增長(zhǎng)，但高果糖組附睪脂肪含量明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。高果糖組的血葡萄糖與對(duì)照組無(wú)差異，但ipGTT實(shí)驗(yàn)后的血糖曲線下面積明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，提示存在機(jī)體胰島素抵抗。與對(duì)照組相比，高果糖組的肝臟TG水平顯著增高(P ＜0.01)，見表1。

2 肝臟病理變化

肝組織HE染色切片顯示對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索排列整齊，脂滴少見;高果糖組小鼠肝細(xì)胞脂滴數(shù)量明顯增多，部分肝細(xì)胞脂肪變性，多數(shù)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚完整，見圖1。

表1 兩組小鼠喂養(yǎng)3 d后的各項(xiàng)指標(biāo)Table 1.Comparison of parameters in the 2 groups of mice after 3－day feeding(.n=20)

表1 兩組小鼠喂養(yǎng)3 d后的各項(xiàng)指標(biāo)Table 1.Comparison of parameters in the 2 groups of mice after 3－day feeding(.n=20)

＊＊P ＜ 0.01 vs control.FBG:fasting blood glucose;AUC:area under curve.

Group Body weight(g) Epdydimal fat(g/100 g BW) FBG(mmol/L) AUC of ipGTT TG content in liver(μmol/g)Control 26.2 ±0.6 1.2 ±0.1 6.2 ±0.1 1014 ±39 10.05 ±0.34 HFru 25.1 ±0.5 1.6 ±0.1＊＊ 6.3 ±0.2 1399 ±54＊＊ 23.42 ±3.96＊＊

Figure 1.Pathological changes of liver tissues in mice after 3－day feeding(HE staining，×400).A:control group;B:HFru group.圖1 小鼠喂養(yǎng)3 d后肝臟病理變化

3 兩組肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)酶類表達(dá)情況

與對(duì)照組相比，高果糖組脂質(zhì)合成相關(guān)酶類ACC、FAS和SCD－1的表達(dá)均明顯增加(P＜0.01)，提示高果糖組內(nèi)源性脂質(zhì)合成增加，見圖2。

4 兩組肝臟胰島素敏感性評(píng)估

與對(duì)照組相比，高果糖組小鼠基礎(chǔ)狀態(tài)時(shí)p－Akt/t－ Akt和 p － GSK －3α/β/t－ GSK －3α/β 的比值無(wú)明顯差異(P＞0.05);胰島素注射40 min后，與對(duì)照組相比，高果糖組p－Akt/t－Akt顯著減少(P＜0.01)，差異顯著;與對(duì)照組相比，高果糖組的p－ GSK －3α/β/t－ GSK －3α/β 的比值亦顯著減少(P＜0.01)，差異顯著(P＜0.01)，提示高果糖組小鼠的肝臟對(duì)胰島素敏感性減低，胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱，見圖3。

討 論

肝臟是人體功能最活躍的合成和分解代謝器官之一，肝臟對(duì)糖、脂、蛋白的代謝均有直接的影響。本研究證明了3 d高果糖喂養(yǎng)即可引起小鼠肝臟脂質(zhì)沉積，表現(xiàn)為甘油三酯含量增高和肝細(xì)胞內(nèi)脂滴形成，說(shuō)明肝臟對(duì)飲食因素具有非常迅速的反應(yīng)，也證實(shí)了果糖對(duì)肝臟和機(jī)體代謝的危害［5］。

Figure 2.Protein expression of lipogenic enzymes in mouse livers in the 2 groups.A:ACC;B:FAS;C:SCD － 1.＊＊ P ＜0.01 vs control.圖2 兩組小鼠肝臟脂代謝相關(guān)酶類蛋白表達(dá)的變化

果糖為己糖單糖，為葡萄糖的同分異構(gòu)體。自然界中果糖以游離狀態(tài)大量存在于水果的漿汁和蜂蜜中;加工食品如軟飲料、糖果、面包等中的蔗糖與高果糖玉米糖漿(high－fructose corn syrup，HFCS)含有多量果糖。自上世紀(jì)70年代HFCS引入食品加工業(yè)，果糖的人群攝入量也相應(yīng)增加［6］。既往研究發(fā)現(xiàn)慢性高果糖喂養(yǎng)刺激肝臟脂質(zhì)從頭合成而誘導(dǎo)脂肪肝的發(fā)生［7］。通過(guò)本研究表明，果糖過(guò)量攝入對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝有直接而迅速的影響，可在3 d之內(nèi)就引起肝臟的脂質(zhì)沉積。肝臟脂質(zhì)從頭合成關(guān)鍵酶為ACC、FAS和SCD－1，本研究發(fā)現(xiàn)3 d果糖過(guò)量攝入后肝臟FAS、ACC、SCD－1的表達(dá)即明顯增加，使脂肪酸從頭合成途徑增強(qiáng)，提示與長(zhǎng)期高果糖喂養(yǎng)相同，脂質(zhì)從頭合成增強(qiáng)是短期高果糖飲食引起脂肪肝的重要機(jī)制之一。

Figure 3.The change in phosphorylation of Akt and GSK －3α/β in mouse livers after insulin stimulation.＊＊P ＜0.01 vs control+Ins.圖3 兩組小鼠胰島素刺激后肝臟Akt和GSK－3α/β的磷酸化變化

同時(shí)，高果糖喂養(yǎng)3 d后的小鼠糖耐量試驗(yàn)表明機(jī)體的糖耐量已經(jīng)下降，同時(shí)伴有小鼠附睪脂肪增多。本研究進(jìn)一步評(píng)價(jià)了小鼠肝臟的胰島素敏感性。已知磷脂酰激醇－3激酶(PI－3K)－PKB(亦稱Akt)途徑是將胰島素作用向肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要信號(hào)途徑之一。胰島素受體底物Akt是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中位于PI－3K下游重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶，GSK －3α/β 是 Akt的直接底物［8］。因此，本研究選用Akt和GSK－3α/β作為評(píng)價(jià)小鼠肝臟胰島素敏感性的指標(biāo)，經(jīng)胰島素注射40 min后，與對(duì)照組相比，高果糖喂養(yǎng)小鼠的肝臟胰島素信號(hào)通路下游因子Akt和GSK－3α/β的磷酸化蛋白表達(dá)均顯著降低，表明高果糖喂養(yǎng)小鼠的肝臟胰島素敏感性均下降，出現(xiàn)了肝臟胰島素抵抗。以上對(duì)整體糖耐量和肝臟胰島素敏感性的評(píng)估結(jié)果表明，短期過(guò)量的果糖攝入對(duì)小鼠肝臟脂代謝和肝胰島素敏感性均有不利的影響。另外，3 d高果糖喂養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠肝臟同時(shí)出現(xiàn)甘油三酯沉積和肝臟胰島素抵抗，提示脂肪肝和肝胰島素抵抗密切相關(guān)，為并行出現(xiàn)機(jī)體代謝障礙的表現(xiàn);然而，本研究結(jié)果尚不能確定肝臟胰島素抵抗和脂肪肝發(fā)生發(fā)展的先后關(guān)系和因果關(guān)系，二者的關(guān)系還需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究提示短期高果糖飲食通過(guò)刺激內(nèi)源性肝臟脂質(zhì)合成引起脂肪肝和肝臟胰島素抵抗，并伴有小鼠機(jī)體糖耐量減低，揭示了高果糖飲食對(duì)肝臟及全身代謝的危害與脂肪肝和胰島素抵抗有密切聯(lián)系。

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