王小娜， 李 正， 王 瑒， 蘭愛平， 吳 文

(1 南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州510515;2廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省人民醫(yī)院東病區(qū)內(nèi)分泌科，廣東 廣州510080;3中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣東 廣州510080)

雷奈酸鍶(strontium ranelate，Sr)是一種新型的抗骨質(zhì)疏松藥物，具有抑制破骨細(xì)胞骨吸收和促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成的雙重作用［1］。臨床試驗(yàn)表明，它能夠降低絕經(jīng)后婦女發(fā)生椎體骨折和非椎體骨折的風(fēng)險，同時能預(yù)防骨量減低［2－3］。已有研究表明鍶可通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal－regulated kinase 1/2，ERK1/2)和p38 絲裂原激活蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)信號通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2 的轉(zhuǎn)錄活性，Runx2 則調(diào)節(jié)下游成骨蛋白，如骨鈣素(osteocalcin，OCN)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)Ⅱ型膠原(collagen type Ⅱ，Col Ⅱ)的表達(dá)，促進(jìn)MSCs 的成骨分化［4－5］。而近年發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor β1，TGF－β1)在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells，rBMSCs)成骨分化過程中也起著重要作用，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫作用［6］。體外實(shí)驗(yàn)表明，TGF－β1可促進(jìn)骨膜間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖分化，促進(jìn)成骨(軟骨)細(xì)胞的增殖，刺激Runx2、I 型膠原、骨連結(jié)素(ostocnectin)和OPN 的合成。同時，可抑制破骨細(xì)胞的生成以及成熟破骨細(xì)胞的活性，從而抑制骨吸收作用，并降低成脂標(biāo)志物的表達(dá)［7］。由此可見，TGF－β1在骨組織代謝過程中起著十分重要的作用。然而，Sr能否通過TGF－β1促進(jìn)rBMSCs 向成骨細(xì)胞分化尚未見報道。為此，本文旨在重點(diǎn)探討:(1)Sr 對rBMSCs TGF－β1表達(dá)的影響;(2)TGF－β1是否在Sr 促進(jìn)rBMSCs 向成骨細(xì)胞分化中起作用，以便為Sr 的促成骨作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)資料。

材 料 和 方 法

1 主要材料

Sr 干混懸劑由Servier 公司提供;4 周齡雄性SD大鼠購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心;DMEM/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibico;青霉素、鏈霉素購自華北制藥;細(xì)胞裂解液、地塞米松、維生素C、β－甘油磷酸鈉、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)購自Sigma;堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;細(xì)胞茜素紅鈣染色試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥有限公司;兔抗大鼠TGF－β1單克隆抗體和SB431542 購自Bioworld。

2 主要方法

2.1 rBMSCs 的分離培養(yǎng)及傳代 取4 周齡，雌雄不限SD 大鼠頸推脫臼處死，75%乙醇浸泡10 min，無菌條件下剪除雙側(cè)股骨和脛骨，剔除其表面肌肉及軟組織，用10 mL 注射器吸取含有10%胎牛血清、1 ×105U/L 青霉素G、100 mg/L 鏈霉素的DMEM/F12 培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，直至骨髓腔發(fā)白。移至15 mL離心管，1 000 r/min 離心10 min，制成單細(xì)胞懸液，以(1 ～3)×105cells/cm2接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后半量換液，以后每2 ～3 d 換1 次液，至細(xì)胞融合至80%時，用成骨誘導(dǎo)液(含10－8地塞米松、0.2 mmol/L維生素C 和10 mmol/L β－甘油磷酸鈉)培養(yǎng)rBMSCs［8］。本實(shí)驗(yàn)原代rBMSCs 培養(yǎng)1 ～2 d 即可見到細(xì)胞貼壁，4 ～5 d 觀察到成纖維細(xì)胞集落形成，懸浮的淋巴細(xì)胞等造血系細(xì)胞經(jīng)過換液操作后大部分被去除，9 ～11 d 細(xì)胞集落間相互融合成單層，形態(tài)多為梭形成纖維細(xì)胞。

2.2 ALP 的測定 取培養(yǎng)第3 ～5 代的細(xì)胞，以1 ×108/L 的密度接種于96 孔板，每孔200 μL，每孔設(shè)4個復(fù)孔。檢測時將細(xì)胞洗滌后以0.2 % Triton X－100 裂解液及反復(fù)凍融法充分裂解，裂解液經(jīng)低溫離心機(jī)12 000 ×g 離心10 min，取上清50 μL ，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀520 nm 波長處測定ALP 值。

2.3 細(xì)胞茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色 取培養(yǎng)第3 ～5 代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 × 108/L ，接種于6 孔板，6 孔板底部預(yù)先置入消毒過的載玻片，給予相應(yīng)的處理因素后第21 d 按照細(xì)胞茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色試劑盒說明書對樣本進(jìn)行固定、染色及澄清處理，倒置顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)染色情況，每組取4 個樣本，每樣本隨機(jī)取1 個視野(×100)，比較各組間的差異。

2.4 Western blotting 檢測TGF－β1表達(dá)及半定量分析 收集的細(xì)胞用冰冷的PBS 洗滌細(xì)胞2 次，加適量細(xì)胞裂解液，在冰上將細(xì)胞迅速刮下，將裂解產(chǎn)物移至EP 管，10 000 r/min 離心10 min，吸出上清液體，用BCA 方法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定。將提取的蛋白質(zhì)樣品加入等體積上樣緩沖液，100 ℃煮5 min，在15%聚丙烯酰氨凝膠電泳，電泳后將膠上所需蛋白條帶轉(zhuǎn)印至PVDF 膜。PVDF 膜用5%脫脂奶粉室溫下封閉90 min，加入1∶1 000 稀釋的抗TGF－β1的Ⅰ抗，置于4 ℃孵育過夜。用含0.1%吐溫－20 的TBST 緩沖液(TBS/T)洗膜3 次，每次5 min。然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，以1∶2 500 稀釋，室溫孵育90 min，TBS/T 洗膜3 次，每次5 min。最后采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影，掃描檢測蛋白表達(dá)狀況。用Smartview 軟件分析目標(biāo)條帶灰度值，與內(nèi)參照actin 條帶灰度值校正后進(jìn)行半定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 Sr 增加rBMSCs ALP 活性

圖1 顯示，應(yīng)用0. 1 ～7 mmol/L Sr 分別處理rBMSC 7 d，均能明顯增加ALP 活性，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P ＜0.05)。其中3 mmol/L Sr 對ALP 活性的促進(jìn)作用最大。

Figure 1. Effects of strontium ranelate (Sr)at different concentrations on activity of ALP in BMSCs of rats. #P ＜0.05，##P ＜0.01 vs control.圖1 不同濃度Sr 對rBMSCs ALP 活性的影響

2 Sr 促進(jìn)rBMSCs 的鈣結(jié)節(jié)形成

圖2 顯示，3 mmol/L Sr 處理rBMSCs 21 d，可明顯地增加鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量及面積。

3 Sr 對rBMSCs TGF－β1 表達(dá)的影響

圖3A 顯示，應(yīng)用0.1 ～5 mmol/L Sr 處理rBMSCs 7 d 均可明顯上調(diào)TGF－β1表達(dá)，其中1 mmol/L Sr 對TGF－β1表達(dá)的上調(diào)作用最大，TGF－β1表達(dá)是對照組的3.1 倍(P ＜0.01)。但是，7 mmol/L Sr對TGF－β1表達(dá)無明顯作用(P ＞0.05)。圖3B 顯示，在應(yīng)用1 mmol/L Sr 處理rBMSCs 1 ～7 d，Sr 呈時間依賴性地上調(diào)TGF－β1表達(dá)，其中處理細(xì)胞7 d 時，TGF－β1的表達(dá)水平達(dá)到最高峰。然而，1 mmol/L Sr 處理rBMSCs 10 d 時對TGF－β1表達(dá)無明顯影響。

Figure 3. Effects of Sr on expression of TGF－β1 in BMSCs.A:rBMSCs were treated with Sr at 0.1 to 7 mmol/L for 7 d;B:rBMSCs were treated with 1mmol/L Sr for 1 to 7 d. ±s.n=6. #P ＜0.05，##P ＜0.01 vs control.圖3 Sr 對rBMSCs TGF－β1 表達(dá)的影響

4 TGF－β1 抑制劑拮抗Sr 對TGF－β1 表達(dá)的上調(diào)作用

圖4 顯示，應(yīng)用1 mmol/L Sr 處理rBMSCs 7 d 可明顯上調(diào)TGF－β1的表達(dá)(P ＜0.01);在Sr 處理細(xì)胞前2 h，應(yīng)用10 μmol/L SB431542(TGF－β1抑制劑)預(yù)處理細(xì)胞可顯著地阻斷Sr 對TGF－β1表達(dá)的上調(diào)作用;10 μmol/L SB431542 或DMSO 對TGF－β1的基礎(chǔ)表達(dá)水平無明顯影響。

5 TGF－β1 抑制劑拮抗Sr 對ALP 活性的促進(jìn)作用

圖5 顯示，應(yīng)用1 mmol/L Sr 處理rBMSCs 7 d 可明顯增加ALP 活性，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);在Sr 處理細(xì)胞前2 h，用10 μmol/L SB431542(TGF－β1抑制劑)預(yù)處理細(xì)胞可明顯地抑制Sr 對ALP 活性的促進(jìn)作用，與Sr 處理組比較，差異顯著(P ＜0.05)。10 μmol/L SB431542 或DMSO對ALP 活性無明顯的作用。

Figure 4. SB431542(inhibitor of TGF－β1，10 μmol/L)preconditioning inhibited Sr－induced overexpression of TGF－β1 in rBMSCs.Sr:rBMSCs were treated with 1 mmol/L Sr for 7 d;Sr+SB431542:rBMSCs were pretreated with SB431542 for 2 h，followed by the treatment with Sr(1 mmol/L)for 7 d;SB431542:rBMSCs were treated with SB431542 for 2 h and then with DMSO for 7 d;DMSO:rBMSCs were cultured with DMSO for 7 d. ±s.n=5. ##P ＜0.01 vs control;＊＊P ＜0.01 vs Sr.圖4 TGF－β1 抑制劑阻斷Sr 對rBMSCs TGF－β1 表達(dá)的上調(diào)作用

Figure 5. Preconditioning with SB431542(10 μmol/L)inhibited Sr－induced activity enhancement of ALP in BMSCs.Sr:rBMSCs were treated with 1 mmol/L Sr for 7 d;Sr+SB431542:rBMSCs were pretreated with SB431542 for 2 h，followed by the treatment with Sr(1 mmol/L)for 7 d;SB431542: rBMSCs were treated with SB431542 for 2 h and then with vechicle for 7 d;DMSO:rBMSCs were cultured by DMSO for 7 d. ±s.n=5. #P ＜0.05 vs control;* P ＜0.05 vs Sr.圖5 TGF－β1 抑制劑阻斷Sr 對ALP 活性的增強(qiáng)作用

6 TGF－β1 抑制劑阻斷Sr 對鈣結(jié)節(jié)形成的促進(jìn)作用

圖6 顯示，1 mmol/L Sr 處理rBMSCs 21 d 可顯著的增加鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量;在Sr 處理細(xì)胞前2 h，應(yīng)用TGF－β1抑制劑SB431542(10 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞能明顯地抑制Sr 對鈣結(jié)節(jié)形成的促進(jìn)作用;10 μmol/L SB431542 或DMSO 本身對鈣結(jié)節(jié)數(shù)量無明顯影響。

討 論

Figure 6. Preconditioning with SB431542(10 μmol/L)inhibited Sr－induced mineralization in BMSCs(alizarin red staining，×100).A:control;B:rBMSCs were treated with 1 mmol/L Sr for 21 d;C:rBMSCs were pretreated with SB431542 for 2 h，followed by the treatment with Sr(1 mmol/L);D:rBMSCs were treated with SB431542 for 2 h and then with DMSO for 21 d;D:rBMSCs were cultured by DMSO for 21 d.圖6 TGF－β1 抑制劑(SB431542)對鈣結(jié)節(jié)形成的影響

ALP 是細(xì)胞成骨分化的一個早期指標(biāo)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞礦化的重要酶之一。本研究采用ALP 及鈣結(jié)節(jié)形成作為判斷rBMSCs 向成骨細(xì)胞分化的指標(biāo)。研究結(jié)果表明，新型的抗骨質(zhì)疏松劑Sr 能明顯的增加rBMSCs 的ALP 活性及鈣結(jié)節(jié)數(shù)量，提示Sr 具有促進(jìn)rBMSCs 向成骨細(xì)胞分化的作用，這與文獻(xiàn)報道［1，4－5，9－11］的結(jié)果一致。TGF－β1屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF－β)超家族成員之一，它是一個分泌型多肽信號分子，生物活性極其廣泛，能調(diào)控多種間充質(zhì)來源的細(xì)胞增殖和定向分化、尤其是在細(xì)胞成骨分化、骨基質(zhì)合成和骨重建中起著重要的作用，是調(diào)控rBMSCs 的首選生長因子之一［10，12］。TGF－β1也是人類骨骼中含量最豐富的生長因子，通過影響rBMSCs 向成骨細(xì)胞方向的轉(zhuǎn)化而影響正常及病理下的骨骼形態(tài)［13］。已有研究表明，TGF－β1可能在鍶促進(jìn)rBMSCs 向成骨細(xì)胞分化的過程中起著重要的作用［9］。但是，TGF－β1在Sr促進(jìn)rBMSCs 向成骨細(xì)胞分化中的作用如何迄今未見報道。根據(jù)本研究得出的結(jié)果，我們推測TGF－β1可能參與Sr 促進(jìn)rBMSCs 向成骨細(xì)胞分化的過程。本研究在應(yīng)用Sr 處理rBMSCs 前，用TGF－β1特異性抑制劑SB431542 預(yù)處理細(xì)胞，結(jié)果表明，TGF－β1抑制劑不僅能阻斷Sr 對rBMSCs TGF－β1表達(dá)的上調(diào)作用，而且能抑制Sr 對ALP 活性及鈣結(jié)節(jié)形成的促進(jìn)作用，提示通過上調(diào)TGF－β1表達(dá)可能是Sr 促進(jìn)rBMSCs 向成骨細(xì)胞分化的重要作用機(jī)制之一。

然而，對于TGF－β1在調(diào)節(jié)成骨中的作用有不同的意見。Shingo 等［14］認(rèn)為，TGF－β1對于骨形成具有促進(jìn)和抑制的雙重作用［11］。TGF－β1也能促進(jìn)rBMSCs 的遷移，具有促進(jìn)骨形成和骨吸收的雙重作用［15］。但是，Zhao 等［7］卻觀察到TGF－β1可促進(jìn)鼠類BMSCs 的成骨分化，表現(xiàn)在它能增加Runx2、OPN 及Col I mRNA 表達(dá)及ALP 活性。因此，有關(guān)TGF－β1在促進(jìn)rBMSCs 向成骨細(xì)胞分化中的作用仍需作進(jìn)一步的探討。

綜上所述，本研究證實(shí)Sr 可促進(jìn)rBMSCs 向成骨細(xì)胞分化，此作用可能與其上調(diào)TGF－β1表達(dá)有關(guān)。本文為深入闡明Sr 的促成骨機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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