舒建昌, 朱海燕, 呂 霞, 何雅軍, 陳蓮香, 葉國榮

(暨南大學(xué)附屬廣州紅十字會(huì)醫(yī)院 消化內(nèi)科，廣東 廣州 510220)

神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)肝星狀細(xì)胞膠原分泌及形態(tài)學(xué)的影響*

舒建昌△, 朱海燕, 呂 霞, 何雅軍, 陳蓮香, 葉國榮

(暨南大學(xué)附屬廣州紅十字會(huì)醫(yī)院 消化內(nèi)科，廣東 廣州 510220)

目的： 觀察神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞(HSCs)膠原分泌功能和形態(tài)學(xué)的影響，探討NGF抗肝纖維化的作用機(jī)制。方法大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSCs-T6)經(jīng)不同濃度NGF作用24 h后，ELISA法檢測(cè)上清液中Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量；通過倒置顯微鏡、吖啶橙染色及透射電鏡觀察形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果NGF作用HSCs 24 h后培養(yǎng)上清中Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量與對(duì)照組相比明顯減少(Plt;0.05)，但無劑量依賴性。倒置顯微鏡下可見細(xì)胞數(shù)目變少，細(xì)胞變小，形態(tài)向橢圓形或圓形改變；吖啶橙染色及透射電鏡可以見到細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)論NGF可抑制HSCs合成Ⅰ、Ⅲ型膠原,誘導(dǎo)HSCs凋亡,抑制HSCs膠原分泌，可能是NGF抗肝纖維化的作用機(jī)制。

肝星狀細(xì)胞； 膠原； 形態(tài)學(xué)； 神經(jīng)生長(zhǎng)因子

肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)又名Ito細(xì)胞、竇周細(xì)胞等，其激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。活化的HSCs大量合成和分泌膠原等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，由于細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解失平衡，合成增多，降解減少，使大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積，最終引起肝纖維化、肝硬化。近年來神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)在肝纖維化中的作用越來越受到關(guān)注[1-3]。本研究觀察了NGF對(duì)HSCs膠原分泌及形態(tài)學(xué)的影響，以幫助探討NGF抗肝纖維化作用的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

NGF購自Ramp;D；吖啶橙購自Sigma；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自Gibco；ELx800酶標(biāo)儀購自BioTek；LSM 510 META激光共聚焦顯微鏡購自Zeiss。HSCs - T6 由上海中醫(yī)藥大學(xué)徐列明教授提供,系SV40 轉(zhuǎn)染的大鼠肝星狀細(xì)胞,具有活化HSCs 的表型。

2方法

2.1NGF貯存液 NGF粉末用含0.1% BSA的無菌PBS溶解，配制成100 mg/L的貯存液，-20 ℃保存，1個(gè)月內(nèi)有效。使用時(shí)用含10%血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

2.2細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代 采用含1×105U/L青霉素、1×105U/L鏈霉素、10 %胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液,在37 ℃、5 %CO2及飽和濕度下培養(yǎng),隔天換液,待細(xì)胞長(zhǎng)至80 %～90 %密度時(shí),用0.02 %EDTA 和0.25 %胰蛋白酶消化, 按1∶4傳代。

2.3Ⅰ、Ⅲ型膠原的檢測(cè) 采用雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×108/L細(xì)胞密度接種于T-25培養(yǎng)瓶中，24 h后各加入不同濃度(0、100、200、400 μg/L)的NGF培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)上清液，分別取已包被抗大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原單抗的96孔酶標(biāo)板，每孔按照上清液編號(hào)分別加入100 μL上清液和100 μL標(biāo)準(zhǔn)品，37 ℃孵育60 min；每孔內(nèi)加入350 μL洗滌液洗滌反應(yīng)板，反復(fù)洗滌5次；每孔分別加入新鮮稀釋的生物素化抗大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原，37 ℃孵育60 min；同上洗滌5次；每孔加入HRP稀釋液，37 ℃孵育30 min；同上洗滌5次；再加入TMD顯色液，37 ℃暗處孵育20 min；每孔加入終止液，輕輕混勻30 s，30 min內(nèi)在450 nm處讀取A值；以A值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)培養(yǎng)液上清樣品的A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

2.4吖啶橙染色 提前消毒6孔板及以多聚賴氨酸處理的蓋玻片(面積約4 cm2)，在6孔板每孔放置蓋玻片1張。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以7×107/L細(xì)胞密度滴加于提前處理好的置于6孔板內(nèi)的蓋玻片上，每孔滴加0.4 mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)箱中孵育24 h，以100 μg/L NGF為實(shí)驗(yàn)濃度作用于培養(yǎng)細(xì)胞，再培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并拍照，每孔加入PBS洗滌玻片10 min×3次，加入4%多聚甲醛2 mL固定30 min，棄去固定液，每孔再加入蒸餾水洗滌玻片。精確稱取吖啶橙10 mg，溶于100 mL三蒸水中，配制成100 g/L的吖啶橙染液，取染液2 mL將每張蓋玻片浸泡染色7 min， 再于0.01 mol/L PBS中洗滌5 min×3次，直接在載玻片上封片，即在共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2.5透射電鏡觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將5×108/L細(xì)胞接種于T-25培養(yǎng)瓶中，取100 μg/L NGF作為實(shí)驗(yàn)濃度，與HSCs共同孵育24 h后，收集懸浮與貼壁細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，0.01 mol/L PBS重懸細(xì)胞，2.5%戊二醛固定15 min，1%四氧化鋨固定30 min，常規(guī)電鏡樣品制備程序脫水、包埋、超薄切片和鈾鉛染色，透射電鏡觀察并照相。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1HSCs分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原的檢測(cè)結(jié)果

各濃度NGF對(duì)HSCs合成Ⅰ、Ⅲ型膠原均有抑制作用(Plt;0.05)，但各濃度間無顯著差異(Pgt;0.05)，見表1。

表1 不同濃度NGF對(duì)HSCs合成Ⅰ、Ⅲ型膠原的影響

2倒置顯微鏡觀察結(jié)果

倒置顯微鏡下，可見對(duì)照組HSCs呈梭形、星形或形態(tài)不規(guī)則，胞體近中央處有橢圓形的胞核，呈成纖維細(xì)胞樣表型。而100 μg/L NGF與HSCs作用24 h后，倒置顯微鏡下可見細(xì)胞增殖減慢，細(xì)胞數(shù)量變少，細(xì)胞體積變小，部分細(xì)胞脫落，見圖1。

Figure 1. Effect of 100 μg/L NGF on the morphological changes of HSCs observed by inverted microscopy (×200).A:control;B:NGF 100 μg/L.

3吖啶橙染色結(jié)果

對(duì)照組細(xì)胞多呈梭形、星形，胞體舒展，形態(tài)較一致；胞核規(guī)整，為圓形或類圓形，為均勻一致的綠色熒光；胞漿發(fā)桔紅色熒光。100 μg/L NGF作用HSCs后細(xì)胞數(shù)量減少，且細(xì)胞體積縮小、形態(tài)不規(guī)整，細(xì)胞核固縮，熒光增強(qiáng)，可見濃縮致密的暗綠色或黃綠色熒光，見圖2。

Figure 2. Effect of 100 μg/L NGF on the morphological changes of HSCs observed by acridine orange staining (×200).A:control;B:NGF 100 μg/L.

4透射電鏡觀察結(jié)果

100 μg/L NGF作用HSCs后，凋亡細(xì)胞體積較正常細(xì)胞明顯縮小，核染色質(zhì)濃縮，沿核膜排列，細(xì)胞器也發(fā)生濃縮，并可以見到凋亡小體形成，見圖3。

Figure 3. Effect of 100 μg/L NGF on the morphological changes of apoptosis of HSCs observed by TEM.A: normal HSCs(×6 200); B: chromatin condensation and margination inside the nuclear membrane(×8 900); C: nuclear chromatin condensation and shrinkage(×15 000); D: reduced nuclear volume, cleavage into multiple dense bodies, and apoptotic body formation with complete membrane framework (×8 900).B,C,D:100 μg/L NGF group.

討 論

肝纖維化是所有慢性肝病共有的病理改變。HSCs激活是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)，正常的HSCs處于靜止?fàn)顟B(tài)，激活后發(fā)生表型轉(zhuǎn)換成為肌成纖維樣細(xì)胞，細(xì)胞大量增殖，進(jìn)而分泌Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原、層黏連蛋白等多種ECM成分，造成以Ⅰ、Ⅲ型膠原為主要成分的ECM 合成增多、降解相對(duì)不足，甚至降解被抑制，最終可造成ECM在肝內(nèi)過量沉積，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[4]。

NGF除了具有神經(jīng)營養(yǎng)因子的一般功能外，還可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，多是通過低親和力受體——p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)來介導(dǎo)。當(dāng)僅有p75NTR單獨(dú)存在，而無高親和力受體(TrkA)表達(dá)時(shí)，NGF與p75NTR結(jié)合可引起細(xì)胞凋亡[5]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB ( nuclear factor-κB,NF-κB)普遍存在于多種細(xì)胞中,在受到氧自由基、內(nèi)毒素等刺激時(shí)NF - κB 可被激活,啟動(dòng)一些相應(yīng)的基因,導(dǎo)致機(jī)體一系列的改變[6]，研究發(fā)現(xiàn)：肝臟受損時(shí)肝細(xì)胞可表達(dá)NGF；用重組體NGF培養(yǎng)HSCs，細(xì)胞凋亡明顯增多，且具有劑量依賴性，NGF能降低P50/P65 NF - κB異源二聚體活性，其中NF-κB的降低伴隨著caspase-3活性的顯著增高[7]。給予外源性NGF(0.1～100 μg/L)干預(yù)HSCs后，以吖啶橙染色觀察細(xì)胞凋亡數(shù)目，發(fā)現(xiàn)NGF濃度為100 μg/L時(shí)，HSCs表現(xiàn)明顯的凋亡[2]。本小組前期研究也發(fā)現(xiàn)HSCs在100 μg/L的NGF作用下，細(xì)胞增殖被抑制并出現(xiàn)凋亡(結(jié)果另文發(fā)表)。

目前尚未見有關(guān)NGF作用HSCs后對(duì)Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)影響的研究報(bào)道，本研究采用ELISA方法檢測(cè)經(jīng)過NGF作用前、后HSCs培養(yǎng)基上清液中Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的變化，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，各濃度NGF作用HSCs后上清液Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)減少，這可能與NGF抑制HSCs增殖、誘導(dǎo)其凋亡，從而影響Ⅰ、Ⅲ型膠原的基因表達(dá)、抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原的分泌等有關(guān)，具體分子生物學(xué)機(jī)制以及對(duì)其它ECM的分泌有無影響還有待進(jìn)一步研究。

吖啶橙熒光染色是觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化的一種簡(jiǎn)便可靠的方法[8]，吖啶橙能夠透過細(xì)胞膜，把細(xì)胞核內(nèi)的DNA染成綠色，細(xì)胞漿內(nèi)的RNA染成桔紅色，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核固縮或碎裂，因此呈現(xiàn)致密濃染的黃綠色，有時(shí)可見碎塊狀[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：NGF作用HSCs后倒置顯微鏡和吖啶橙染色顯示細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞體積縮小、形態(tài)不規(guī)整，細(xì)胞核固縮，吖啶橙染色顯示實(shí)驗(yàn)組熒光增強(qiáng)，可見濃縮致密的暗綠色或黃綠色熒光；透射電鏡可見凋亡細(xì)胞體積較正常細(xì)胞明顯縮小，核染色質(zhì)濃縮，沿核膜排列，細(xì)胞器也發(fā)生濃縮，并可以見到凋亡小體形成，出現(xiàn)了典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化，進(jìn)一步說明經(jīng)NGF作用后HSCs發(fā)生了細(xì)胞凋亡，NGF可能由此而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

NGF的作用特點(diǎn)是針對(duì)不同靶細(xì)胞可能發(fā)揮完全相反的兩種作用，有關(guān)NGF對(duì)HSCs的增殖、凋亡及對(duì)肝纖維化的影響等方面的相關(guān)研究較少。本研究觀察到NGF可抑制HSCs分泌膠原，引起HSCs出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，有助于明確NGF抗肝纖維化的相關(guān)作用機(jī)制。關(guān)于NGF在肝損傷、肝纖維化發(fā)病過程中對(duì)HSCs的具體作用機(jī)制、NGF抗肝纖維化的確切作用機(jī)理等如何，尚需進(jìn)一步深入研究。

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EffectsofNGFoncollagensecretionandmorphologyofhepaticstalletecells

SHU Jian-chang, ZHU Hai-yan, Lü Xia, HE Ya-jun, CHEN Lian-xiang, YE Guo-rong

(DepartmentofGastroenterology,GuangzhouRedCrossHospitalAffiliatedtoJinanUniversity,Guangzhou510220,China.E-mail:shujc62@hotmail.com)

AIM: To investigate the effects of nerve growth factor (NGF) on the changes of collagen secretion and morphology of hepatic stallete cells(HSCs).METHODSRat HSCs were incubated with different concentrations of NGF for 24 h. Collagen I and III in the supernatants of culture medium secreted by HSCs were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. The morphological changes of HSCs were observed under inverted microscope with acridine orange staining and under transmission electronic microscope.RESULTSWhen HSCs was incubated with NGF at concentrations of 100, 200 or 400 μg/L for 24 h, the content of collagen I and collagen III in the culture supernatants were significantly reduced compared with control group (Plt;0.05). After stimulated with NGF at the concentration of 100 μg/L for 24 h, the growth of the HSCs was inhibited and the morphous of the cells became round or oval gradually. The morphological changes of apoptotic cells were also observed by acridine orange staining and transmission electronic microscopy.CONCLUSIONNGF inhibits HSCs to synthesize collagen I and collagen III. Inhibition of collagen production and promotion of apoptosis in HSCs may be the possible mechanisms of NGF to reverse liver fibrosis.

Hepatic stellate cells; Collagen; Morphology; Nerve growth factor

1000-4718(2011)12-2396-03

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.12.030

2011-07-08

2011-11-20

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.9151051501000083);廣州市科技局計(jì)劃(No.2010Y1-C691)

△通訊作者 Tel：020-34403828；E-mail：shujc62@hotmail.com