劉 岸，王 武，陳 兆，吳志豪

(1溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325027;2岳陽(yáng)市第一人民醫(yī)院，湖南 岳陽(yáng) 414000;3溫州醫(yī)學(xué)院附屬眼視光醫(yī)院，浙江 溫州 325000)

新生血管生成在惡性腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用，研究表明血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)具有自我增殖和定向歸巢的特性，可定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而在新生血管生成中發(fā)揮重要作用。百里醌(thymoqinone)是近年來(lái)從產(chǎn)自中東國(guó)家的黑種草籽油中分離出來(lái)的主要有效單體，研究發(fā)現(xiàn)其具有強(qiáng)大的抑癌效應(yīng)，可抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［1，2］，還能抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)介導(dǎo)的血管生長(zhǎng)［3］。但百里醌對(duì)EPCs的影響以及對(duì)人胰腺癌血管生長(zhǎng)的抑制作用卻未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究將探討百里醌對(duì)EPCs體外小管生成的影響以及對(duì)人胰腺癌血管生長(zhǎng)的影響及其可能機(jī)制，為百里醌的臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 主要藥品和試劑

百里醌購(gòu)自Sigma;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、含EDTA胰酶和RPMI－1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco;EGM－2培養(yǎng)基購(gòu)自Lonza;人工重組基底膜(Matrigel)購(gòu)自BD;Ⅰ抗小鼠抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體－2(vascular endothelial growth factor receptor－2，VEGFR－2)單克隆抗體、兔抗VIII因子多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz;Ⅰ抗兔抗CD34多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;人纖連蛋白(human fibronectin，HFN)購(gòu)自Chemicon;ABC免疫組化檢測(cè)試劑盒和AEC染色試劑盒購(gòu)自華美生物工程公司;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和β－actin抗體購(gòu)自Epitomics。百里醌用無(wú)水乙醇配制成10 mmol/L，－20℃冰箱保存，使用時(shí)用不含血清的RPMI－1640培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

2 方法

2.1 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC－1為本實(shí)驗(yàn)室保存，培養(yǎng)在含10%胎牛血清、質(zhì)量濃度1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI－1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)，至70% ～80%融合時(shí)胰蛋白酶消化傳代。

2.2 EPCs的分離和培養(yǎng) 參照楊德業(yè)等［4］的方法收集2010年9月～2010年12月棄用的健康新生兒臍帶血液5例(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院產(chǎn)科)，每次采集臍血量約30 mL。采用密度梯度離心法收集臍血中的單個(gè)核細(xì)胞接種在包被有HFN 10 cm2培養(yǎng)皿中。加入3 mL含10%FBS EGM－2培養(yǎng)液，24 h后更換全部培養(yǎng)液。此后7 d內(nèi)每天更換50%的培養(yǎng)液，7 d后每3 d更換全部培養(yǎng)液，同時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待原代細(xì)胞生長(zhǎng)匯合后傳代進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 EPCs的鑒定 取第2代細(xì)胞接種至24孔板中，培養(yǎng)至貼壁。采用40 g/L多聚甲醛固定20 min，0.3%H2O2－甲醇液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，PBS浸洗后分別加1∶100稀釋的Ⅰ抗小鼠抗VEGFR－2，兔抗VIII因子相關(guān)抗原抗體及兔抗CD34抗體于4℃下孵育過(guò)夜。Ⅱ抗結(jié)合參照ABC免疫組化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，之后用AEC染色試劑染色，蘇木素復(fù)染，在倒置相差顯微鏡下(Nikon，TS100)觀察染色結(jié)果。陰性對(duì)照組為胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC－1。

2.4 動(dòng)物 雌性BALB/c－nu/nu品系的裸小鼠(4－6周齡)，體重18－20 g，購(gòu)自中科院上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)為SCXK(滬)2007－0005。飼養(yǎng)于溫州醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)屏障系統(tǒng)的潔凈層流架內(nèi)，室溫控制在(25±1)℃，相對(duì)濕度40% ～60%，動(dòng)物所需飼料、飲水、籠具和操作器材及其它用品均滅菌處理后使用，實(shí)驗(yàn)時(shí)按無(wú)菌原則操作。

2.5 小管形成實(shí)驗(yàn) 4℃下于96孔板中每孔加入100 μL Matrigel，鋪平后置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)固定5 h。以4×104cells/well接種于培養(yǎng)板，加入不同濃度百里醌(10 nmol/L、20 nmol/L和40 nmol/L)，以溶媒為對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，倒置顯微鏡下觀察并拍照，并計(jì)算不同濃度百里醌作用后EPCs小管生成的抑制率。

2.6 Western印跡檢測(cè)PANC－1細(xì)胞中VEGF的表達(dá) 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胰腺癌PANC－1細(xì)胞，不同濃度百里醌(20 μmol/L、40 μmol/L 和80 μmol/L)(微摩爾級(jí)濃度百里醌對(duì)于EPCs來(lái)說(shuō)濃度太高，20 μmol/L的百里醌作用48 h可完全殺滅該細(xì)胞，因此作用EPCs的百里醌選用納摩爾級(jí)濃度)作用PANC－1細(xì)胞48 h后，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取上清液，測(cè)量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品(20 μg/well)，8%SDS－PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉后滴加兔抗人VEGF抗體為第Ⅰ抗體，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為第Ⅱ抗體，ECL顯色，X線膠片曝光。

2.7 裸鼠胰腺癌原位移植瘤模型制備及實(shí)驗(yàn)干預(yù)

①制備胰腺癌皮下移植瘤模型 取3×106個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC－1細(xì)胞懸浮為0.2 mL細(xì)胞懸液，注射至裸鼠腋部皮下，待腫瘤生長(zhǎng)成1 cm×1 cm×1 cm大小后取出，無(wú)菌條件下去除中央壞死組織，選取周圍健康腫瘤組織剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊。

②制備外科胰腺癌原位移植模型 戊巴比妥鈉(50 mg/kg BW)腹腔麻醉裸鼠，經(jīng)左上腹直腸旁線切口后，仔細(xì)暴露胰腺，術(shù)者佩戴手術(shù)放大鏡后小心剪開(kāi)胰腺被膜，將瘤塊植入胰尾處。以8－0可吸收外科縫線縫合胰腺被膜，將胰腺輕輕送回腹腔，6－0可吸收外科縫線單層縫合腹壁肌層及皮膚。以上所有操作均在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。共制備20只裸鼠，隨機(jī)分成2組，每組10只。手術(shù)后第3周開(kāi)始給藥，對(duì)照組每只裸鼠1%乙醇0.2 mL灌胃;百里醌給藥采用灌胃，劑量為20 mg/kg［2］，每周3次，持續(xù)給藥3周。術(shù)后第8周處死老鼠，并計(jì)算裸鼠8周生存率;鼠重變化ΔBW(g)=治療后鼠重－治療前鼠重;抑瘤率 =1－治療組與對(duì)照組腫瘤實(shí)際重量的比值。

2.8 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)裸鼠胰腺腫瘤組織中Ki－67、CD34和VEGF的表達(dá) 每組各選取5個(gè)腫瘤組織，按照Envision法的操作步驟進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，選取新鮮腫瘤組織經(jīng)石蠟切片常規(guī)脫蠟水化、Ⅰ抗孵育和封片后低倍鏡(×100)下尋取血管密度最高的區(qū)域，然后高倍鏡(×400)下隨機(jī)選擇20個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù);同時(shí)在高倍鏡下隨機(jī)選擇20個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野中Ki－67和VEGF陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 EPCs鑒定結(jié)果

用免疫細(xì)胞染色法對(duì)細(xì)胞染色后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面相關(guān)抗原VEGFR－2、VIII因子和 CD34表達(dá)均為陽(yáng)性，見(jiàn)圖1，此類細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPCs。檢測(cè)胰腺癌PANC－1細(xì)胞各抗體表達(dá)均為陰性。

Figure 1.Expression of VEGFR－2(A)，Ⅷ factor(B)and CD34(C)in EPCs(×400).圖1 EPCs細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞免疫組化染色檢測(cè)VEGFR－2、VⅢ因子和CD34的表達(dá)

2 百里醌對(duì)EPCs體外血管生成的抑制作用

不同濃度百里醌(10 nmol/L、20 nmol/L和40 nmol/L)作用EPCs 12 h后，倒置顯微鏡下觀察，低濃度百里醌(10 nmol/L)對(duì)EPCs小管形成無(wú)明顯影響，20 nmol/L百里醌開(kāi)始顯著抑制小管生成，不僅小管數(shù)目減少，而且管腔不完整;以40 nmol/L百里醌抑制EPCs小管生成的效應(yīng)最顯著，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Inhibitory effect of thymoquinone on tubule－like structure formation of EPCs.A:EPCs were cultured on a layer of Matrigel in the presence or absence of thymoquinone for 12 h，and tube formation was determined using a optical microscope(×200);B:tubule－like structure was quantified by manual counting..n=3.*P ＜ 0.05 vs control圖2 百里醌對(duì)體外EPCs小管形成的影響

3 百里醌對(duì)胰腺癌PANC－1細(xì)胞中VEGF表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果表明，低濃度(20 μmol/L)百里醌對(duì)胰腺癌細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，但高濃度(40～80 μmol/L)的百里醌顯著抑制胰腺癌細(xì)胞中VEGF蛋白的表達(dá)水平，以80 μmol/L百里醌抑制作用最明顯，見(jiàn)圖3。

4 百里醌對(duì)體內(nèi)胰腺癌生長(zhǎng)的抑制作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)照組和百里醌組的鼠重均有不同程度的降低，但對(duì)照組的裸鼠體重下降更為明顯(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組少量裸鼠治療期間出現(xiàn)腹瀉、稀便及脫水表現(xiàn)，但療程結(jié)束也隨之停止。實(shí)驗(yàn)第56 d處死動(dòng)物后，百里醌組腫瘤平均重量為(0.27±0.06)g，與對(duì)照組［(1.12 ±0.22)g］相比較差異顯著(P＜0.05);但百里醌組對(duì)胰腺腫瘤預(yù)后無(wú)明顯影響，見(jiàn)表1。

Figure 3.Western blotting analysis of VEGF in whole cell lysates of PANC－1 cells after treated with various concentrations of thymoquinone for 48 h.β － actin protein served as loading control..n=3.*P ＜ 0.05 vs control.圖3 不同濃度的百里醌作用于人胰腺癌PANC－1細(xì)胞48 h后對(duì)VEGF蛋白表達(dá)的影響

表1 百里醌對(duì)荷瘤裸鼠體重、胰腺腫瘤重量、抑瘤率及生存率的影響Table 1.Effects of thymoquinone on body weight，tumor weight，inhibitory rate and survival rate in tumor－bearing nude mice(.n=10)

表1 百里醌對(duì)荷瘤裸鼠體重、胰腺腫瘤重量、抑瘤率及生存率的影響Table 1.Effects of thymoquinone on body weight，tumor weight，inhibitory rate and survival rate in tumor－bearing nude mice(.n=10)

*P ＜0.05 vs control.

Group Tumor weight(g)Inhibitory rate(%)Survival rate(%) ΔBW(g)Control 1.12±0.22 － 80%(8/10)－0.46 ±0.19 Thymoquinone0.27 ±0.06* 75.9 90%(9/10) －0.15 ±0.07*

5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)裸鼠胰腺腫瘤組織中Ki－67、CD34和VEGF蛋白表達(dá)

如圖4所示，免疫組織化學(xué)染色可見(jiàn)對(duì)照組腫瘤組織中大量細(xì)胞Ki－67、CD34和VEGF陽(yáng)性表達(dá)。與對(duì)照組相比較，百里醌組腫瘤組織中Ki－67、CD34和VEGF陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞均明顯減少，見(jiàn)表2。各組腫瘤組織切片經(jīng)PBS代替特異性Ⅰ抗作為空白對(duì)照，腫瘤組織切片鏡下均無(wú)陽(yáng)性表達(dá)。

討 論

Figure 4.Immunohistochemistry for Ki－67，CD34 and VEGF protein expression in harvested tumors from tumorbearing nude mice(×400).圖4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)百里醌對(duì)裸鼠胰腺癌原位移植瘤中Ki－67、CD34和VEGF表達(dá)的影響

表2 百里醌對(duì)腫瘤組織中Ki－67、CD34和VEGF表達(dá)的影響Table 2.Effects of thymoquinone on the expression of Ki－67，CD34 and VEGF in pancreatic cancer samples(.n=20)

表2 百里醌對(duì)腫瘤組織中Ki－67、CD34和VEGF表達(dá)的影響Table 2.Effects of thymoquinone on the expression of Ki－67，CD34 and VEGF in pancreatic cancer samples(.n=20)

*P ＜0.05 vs control group.

Group Ki－67(%)CD34+vesselsVEGF(%)Control 73.8 ±11.5 17.4 ±3.8 81.6 ±6.5 Thymoquinone 43.6 ±9.6* 6.2 ±1.9* 35.7 ±5.7*

在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中，腫瘤大小超過(guò)1～2 mm就需要持續(xù)血供才能維系生長(zhǎng)［5］，而且新生血管在腫瘤組織中呈廣泛而不規(guī)則生長(zhǎng)，血管吻合顯著增多。一旦腫瘤細(xì)胞擁有誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)的能力，腫瘤生長(zhǎng)變得極富有侵犯性，從而為腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移提供便利。近幾十年來(lái)，F(xiàn)olkman 等［6］和 Kerbel等［7］發(fā)現(xiàn)，抑制腫瘤血管生長(zhǎng)可抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，從而改善病人預(yù)后。遺憾的是，當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的血管抑制劑具有一定的毒副作用，如COX－2抑制劑塞來(lái)昔布可引起粒細(xì)胞減少和貧血等不良反應(yīng)［8］。因此，尋求一種天然低毒的血管抑制劑成為抗癌治療的迫切需要。在以往研究中，百里醌顯示出強(qiáng)大的抑瘤效應(yīng)，且沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性［1］，同時(shí)，該藥可有效抑制HUVECs增殖及其功能，從而在其抑制前列腺癌生長(zhǎng)中發(fā)揮了一定的作用［3］。這些提示百里醌可以作為一種新型血管生成抑制劑用于腫瘤治療。

新生血管形成是由一系列步驟組成的生物學(xué)過(guò)程，包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、血管管腔的形成與存活［9，10］。作為多種內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞 EPCs是一種來(lái)源于骨髓的干細(xì)胞，具有運(yùn)動(dòng)、增殖和分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的能力，EPCs在機(jī)體腫瘤血管新生過(guò)程中起到重要作用。首先，EPCs數(shù)量下降會(huì)引起血管修復(fù)能力下降，從而引發(fā)心血管事件［11］;其次，體外注射EPCs可顯著改善肢體血管新生［12］，加速血液循環(huán)［13］;再次，在新生血管形成中，EPCs占內(nèi)皮細(xì)胞總數(shù)的25%之多［14］;最后，EPCs在腫瘤生長(zhǎng)的早期起到至關(guān)重要的作用［15］。在本研究中，我們成功培養(yǎng)出人臍血 EPCs，并經(jīng) VEGFR－2、VIII因子和CD34細(xì)胞免疫組化證實(shí)細(xì)胞的內(nèi)皮屬性，且首次發(fā)現(xiàn)低濃度百里醌可顯著抑制體外EPCs小管形成，具有抑制體外血管生成的能力，與文獻(xiàn)報(bào)道相近［3］;另外，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，我們建立起胰腺癌原位移植模型，發(fā)現(xiàn)百里醌不僅可在對(duì)機(jī)體無(wú)明顯影響的前提下抑制體內(nèi)胰腺腫瘤生長(zhǎng)，還可顯著抑制胰腺腫瘤中CD34陽(yáng)性表達(dá)，表明百里醌可抑制包括EPCs在內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞在胰腺腫瘤中的血管生成，與我們?cè)O(shè)想相符。上述結(jié)果提示里醌作為一種低毒的抑瘤藥物可通過(guò)抑制EPCs體內(nèi)外血管生成，從而可能在其抑制胰腺腫瘤生長(zhǎng)中發(fā)揮了一定的作用。

VEGF是一種重要的血管新生依賴因子，它一方面可通過(guò)增強(qiáng)血管的通透性引起纖維蛋白原等血漿蛋白的外滲，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和新生毛細(xì)血管網(wǎng)提供最佳基質(zhì);另一方面與其受體結(jié)合，發(fā)揮特異性的內(nèi)皮細(xì)胞分裂原的活性，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)血管的新生［7］。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞可分泌VEGF，但缺乏VEGF受體，而內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGF受體卻很少表達(dá)VEGF，因此VEGF在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤組織形成血管的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。最新研究表明，抗VEGF藥物bevacizumab已成為治療乳腺癌的一線化療藥物［16］，顯示血管生成抑制劑良好的抗癌前景。在本研究中，胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC－1中VEGF呈高表達(dá)狀態(tài)，而百里醌不僅可抑制體外胰腺癌細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，還能有效下調(diào)體內(nèi)胰腺腫瘤中VEGF的表達(dá)，表明百里醌可通過(guò)下調(diào)VEGF而抑制胰腺腫瘤中血管生成。

［1］Banerjee S，Kaseb AO，Wang Z，et al.Antitumor activity of gemcitabine and oxaliplatin is augmented by thymoquinone in pancreatic cancer［J］.Cancer Res，2009，69(13):5575－5583.

［2］Jafri SH，Glass J，Shi R，et al.Thymoquinone and cisplatin as a therapeutic combination in lung cancer:In vitro and in vivo［J］.J Exp Clin Cancer Res，2010，29:87.

［3］Yi T，Cho SG，Yi Z，et al.Thymoquinone inhibits tumor angiogenesis and tumor growth through suppressing AKT and extracellular signal－regulated kinase signaling pathways［J］.Mol Cancer Ther，2008，7(7):1789 －1796.

［4］楊德業(yè)，張懷勤，季抗挺，等.內(nèi)皮祖細(xì)胞在體外培養(yǎng)成血管樣結(jié)構(gòu)的初步觀察［J］.中國(guó)病理生理雜志，2006，22(10):1970－1974.

［5］Seno H，Oshima M，Ishikawa TO，et al.Cyclooxygenase 2－and prostaglandin E2receptor EP2－dependent angiogenesis in ApcΔ716mouse intestinal polyps［J］.Cancer Res，2002，62(2):506 －511.

［6］Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeutic implications［J］.N Engl J Med，1971，285(21):1182－1186.

［7］Kerbel RS.Tumor angiogenesis［J］.N Engl J Med，2008，358(19):2039－2049.

［8］Dragovich T，Burris H 3rd，Loehrer P，et al.Gemcitabine plus celecoxib in patients with advanced or metastatic pancreatic adenocarcinoma:results of a phase Ⅱ trial［J］.Am J Clin Oncol，2008，31(2):157 －162.

［9］方 英，傅國(guó)勝，宋筱筱，等.雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2008，24(12):2315－2318.

［10］Bussolino F，Mantovani A，Persico G.Molecular mechanisms of blood vessel formation［J］.Trends Biochem Sci，1997，22(7):251－256.

［11］Kunz GA，Liang G，Cuculi F，et al.Circulating endothelial progenitor cells predict coronary artery disease severity［J］.Am Heart J，2006，152(1):190 －195.

［12］Murohara T，Ikeda H，Duan J，et al.Transplanted cord blood－derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization［J］.J Clin Invest，2000，105(11):1527－1536.

［13］Schatteman GC，Hanlon HD，Jiao C，et al.Blood－derived angioblasts accelerate blood－flow restoration in diabetic mice［J］.J Clin Invest，2000，106(4):571 －578.

［14］Suzuki T，Nishida M，F(xiàn)utami S，et al.Neoendothelialization after peripheral blood stem cell transplantation in humans.A case report of a Tokaimura nuclear accident victim［J］.Cardiovasc Res，2003，58(2):487 －492.

［15］Nolan DJ，Ciarrocchi A，Mellick AS，et al.Bone marrow－derived endothelial progenitor cells are a major determinant of nascent tumor neovascularization［J］.Genes Dev，2007，21(12):1546－1558.

［16］Scott LJ.Bevacizumab:in first－ line treatment of metastatic breast cancer［J］.Drugs，2007，67(12):1793 －1799.