邵淑麗，崔婷婷，賈紅雙，謝振麗，張偉偉，劉 遷，陳薇薇，李 爽，陳 麗

(齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

化療是肺癌的主要治療手段之一，而多藥耐藥是導(dǎo)致肺癌治療失敗的主要原因［1－2］。多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥的同時(shí)，對(duì)其它結(jié)構(gòu)不同、作用靶位不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生抗藥性的現(xiàn)象［3］。腫瘤多藥耐藥的機(jī)制復(fù)雜，其中主要涉及細(xì)胞外排藥物的調(diào)控機(jī)制。已知相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)體(transporter)屬ABC(ATP－binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族是人類最大的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族，編碼產(chǎn)物是一組跨膜蛋白，即ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。其超家族又分為7個(gè)亞家族(ABCA、ABCB、ABCC、ABCD、ABCE、ABCF、ABCG)，包括 49 個(gè)基因。其中參與腫瘤多藥耐藥的主要成員有ABCB1編碼的P－糖蛋白、ABCC1編碼的多藥耐藥相關(guān)蛋白、ABCG2編碼的乳腺癌耐藥蛋白。與腫瘤多藥耐藥相關(guān)的主要基因有位于第7號(hào)染色體的q21.1區(qū)的多藥耐藥蛋白1(multidrug resisitance protein 1，MDR1)基因、位于染色體16q13.1上的多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrug resistance－associated protein，MRP1)基因，和位于人染色體4q22上的乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistence protein，BCRP)基因。肺癌多藥耐藥主要由MRP1基因介導(dǎo)，藥物通過(guò)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽(GSH)結(jié)合，由 MRP1轉(zhuǎn)運(yùn)出胞外［4］。MRP1基因表達(dá)增高可導(dǎo)致多藥耐藥的產(chǎn)生，其編碼產(chǎn)物為多藥耐藥相關(guān)蛋白，分子量為190 kD，屬于跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。RNA干擾(RNA interference)作為一種新的特異性封閉目的基因表達(dá)的方法，已成功用于腫瘤基因功能和基因治療的研究。為了穩(wěn)定、持久地逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞的多藥耐藥性，本研究采用MRP1 shRNA表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染A549/DDP肺癌多藥耐藥細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，有限稀釋法挑取單克隆得到陽(yáng)性單克隆細(xì)胞，探討表達(dá)MRP1 shRNA陽(yáng)性單克隆細(xì)胞與親本A549/DDP多藥耐藥細(xì)胞在多藥耐藥方面的變化。

材料和方法

1 材料

pSilencer 2.1－U6 neo質(zhì)粒(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司周衛(wèi)東老師惠贈(zèng))，敏感的和耐順鉑的肺癌細(xì)胞株A549和A549/DDP(北京腫瘤生物學(xué)檢測(cè)中心)，RPMI－1640培養(yǎng)基和胎牛血清(上海生工)，ECM830型電穿孔儀(BTX)，熒光定量RCP儀(Bio－Rad)，流式細(xì)胞儀(Beckman)，LSM710 激光共聚焦顯微鏡(Zeiss)。

2 方法

2.1 MRP1基因 shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)GenBank MRP蛋白編碼基因MRP1 cDNA的已知序列(GeneID:4363)，選擇2個(gè)shRNA特異性靶位點(diǎn)序列。設(shè)計(jì)合成MRP1基因編碼shRNA的DNA模板，將其定向克隆到pSilencer 2.1－U6 neo載體上，2個(gè)shRNA表達(dá)質(zhì)粒分別命名為pSilencer 2.1－U6 neo MRP1－2.1－1(1214～1234)和 pSilencer 2.1－U6 neo MRP1－2.1－2(1717～1737)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，測(cè)序鑒定。

2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 細(xì)胞均用含0%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI－1640培養(yǎng)液于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為了維持A549/DDP細(xì)胞株的耐藥亞型，培養(yǎng)液中加1.0 mg/L的順鉑。實(shí)驗(yàn)前2周換用無(wú)順鉑的培養(yǎng)液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549/DDP細(xì)胞 ，通過(guò)pEGFP－N1質(zhì)粒優(yōu)化電轉(zhuǎn)染條件，線性化的重組質(zhì)粒于最佳電轉(zhuǎn)染條件下電轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞，用700 mg/L G418篩選而建立穩(wěn)定表達(dá) siRNA的A549/DDP細(xì)胞克隆。有限稀釋法挑取單克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別得到轉(zhuǎn)染單克隆細(xì)胞A549/DDP/sh－2.1－1－1和A549/DDP/sh－2.1－2－1。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MRP1 mRNA 采用UNIQ－10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(Sangon)提取細(xì)胞總RNA。MRP1正義鏈5'－CGCTGAGTTCCTGCGTACC－3'，反義鏈 5'－TCTGCGGTGCTGTTGTGG－3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為213 bp。以β－actin為內(nèi)參照，正義鏈5'－TGACGTGGACATCCGCAAAG －3'，反義鏈 5'－CTGGAAGGTGGACAGCGAGG－3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為 205 bp。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增條件:94℃ 4 min，94℃20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán) 35 次，72 ℃ 檢測(cè)信號(hào)，循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以 2－ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

2.4 免疫熒光檢測(cè)MRP1蛋白的表達(dá) 4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖溶液固定實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞15～20 min，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗2次，加入鼠抗人MRP1單克隆抗體50 μL，室溫孵育1 h，PBS洗1次，洗掉未結(jié)合的Ⅰ抗。加入熒光標(biāo)記Ⅱ抗50 μL，避光室溫孵育1 h，PBS洗去未結(jié)合的熒光Ⅱ抗，碘化丙啶(PI)染色封片，激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)羅丹明 123(rhodamine 123，Rho123)的潴留量 Rho123是MRP1蛋白的作用底物，當(dāng)細(xì)胞的 MRP1合成減少時(shí)，其外排功能降低，Rho123在細(xì)胞內(nèi)的潴留量增加。轉(zhuǎn)染shRNA表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞分別與0.25 mg/L Rho12337℃孵育1 h，用預(yù)冷的 PBS洗3次，以1×109cells/L重懸于預(yù)冷的PBS中。流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞Rho123熒光強(qiáng)度。

2.6 MTT法檢測(cè)耐藥逆轉(zhuǎn)效果 細(xì)胞中分別加入終濃度為 5、10、20、40、80、160、320 μmol/L 順鉑或5 － 氟尿嘧啶，常規(guī)四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)于570 nm下測(cè)吸光度值(A)。計(jì)算細(xì)胞存活率=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%，以藥物濃度為橫軸、細(xì)胞存活率為縱軸繪制濃度效應(yīng)曲線，求出回歸方程，確定半數(shù)抑制濃度(IC50)并計(jì)算相對(duì)逆轉(zhuǎn)率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，行單因素方差分析(One－way ANOVA)，組間比較用LSD法，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。

結(jié) 果

1 MRP1基因shRNA表達(dá)載體的鑒定

經(jīng)測(cè)序結(jié)果鑒定，重組質(zhì)粒的堿基序列與預(yù)期結(jié)果一致，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2 pEGFP－N1質(zhì)粒優(yōu)化電轉(zhuǎn)染條件

電轉(zhuǎn)染時(shí)間定為30 ms，分別調(diào)節(jié)電壓為140 V、160 V、180 V、200 V、220 V、240 V 進(jìn)行電轉(zhuǎn)染條件的摸索。結(jié)果顯示，電壓為180 V時(shí)，細(xì)胞存活率在40% ～50%之間，有約80%的細(xì)胞發(fā)綠色熒光，見(jiàn)圖1。因此，確定脈沖時(shí)間30 ms、電壓180 V為電轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞的最佳條件。

Figure 1.The expression of green fluorescent protein in A549/DDP cells transfected with pEGFP－N1 plasmid for 48 h(×200).圖1 pEGFP－N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞48 h后綠色熒光蛋白的表達(dá)情況

3 熒光定量PCR檢測(cè)MRP1 mRNA的表達(dá)

應(yīng)用定量PCR儀自帶數(shù)據(jù)分析軟件獲得Ct計(jì)算出各組細(xì)胞MRP－1 mRNA表達(dá)值，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞MRP1/β－actin的值。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pSilencer 2.1－U6 neo MRP1－2.1－1－1和pSilencer 2.1－U6 neo MRP1－2.1－2－1可以顯著降低A549/DDP細(xì)胞內(nèi)MRP1 mRNA的表達(dá)，單克隆細(xì)胞A549/DDP/sh－2.1－1－1和A549/DDP/sh－2.1－2－1的MRP1 mRNA/β－actin mRNA比值明顯降低，見(jiàn)圖2。

4 免疫熒光檢測(cè)MRP1蛋白表達(dá)水平

應(yīng)用激光共聚焦圖像分析與免疫熒光技術(shù)對(duì)A549、A549/DDP及轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的單克隆細(xì)胞MRP1蛋白進(jìn)行定位定量研究，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡對(duì)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞不同視野下采集熒光強(qiáng)度，各實(shí)驗(yàn)細(xì)胞采集20組熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)繪制MRP1蛋白表達(dá)變化規(guī)律及蛋白表達(dá)水平圖。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的單克隆細(xì)胞MRP1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，MRP1蛋白位于細(xì)胞膜上，見(jiàn)圖3。MRP1蛋白表達(dá)變化規(guī)律及蛋白表達(dá)水平見(jiàn)圖4、5。

Figure 2.Exppression of MRP1 mRNA..n=3.*P＜0.05 vs A549/DDP or vector control.圖2 各實(shí)驗(yàn)細(xì)胞MRP－1 mRNA表達(dá)

Figure 3.Immunofluorescent staining for MRP1 protein expression.Green color represents MRP1 and blue color represents nuclei.Scale bar:10 μm.圖3 免疫熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中MRP1蛋白表達(dá)

Figure 4.The changes of MRP1 protein expression.圖4 MRP1蛋白表達(dá)變化規(guī)律圖

Figure 5.The expression level of MRP1 protein..n=3.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs A549/DDP or control.圖5 MRP1蛋白表達(dá)水平

5 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)Rho123潴留量的變化

轉(zhuǎn)染單克隆細(xì)胞A549/DDP/sh－2.1－1－1和A549/DDP/sh－2.1－2－1細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增加，與耐藥細(xì)胞株A549/DDP比較，差異顯著(P＜0.05)，見(jiàn)表 1。

表1 各組細(xì)胞Rho123的相對(duì)熒光強(qiáng)度Table 1.Accumulation of Rho123 in the cells of different groups(%..n=3)

表1 各組細(xì)胞Rho123的相對(duì)熒光強(qiáng)度Table 1.Accumulation of Rho123 in the cells of different groups(%..n=3)

*P ＜0.05 vs A549/DDP or vector control.

Group Rho123 retention A549/DDP 16.93 ±0.58 Vector control 18.44 ±0.45 sh－2.1 －1 －1 89.02 ±0.59*sh－2.1 －2 －1 82.56 ±1.37*A549 94.53 ±1.19*

6 多藥耐藥逆轉(zhuǎn)效果

MTT檢測(cè)顯示，與對(duì)照組肺癌親本細(xì)胞相比，穩(wěn)定表達(dá)陽(yáng)性單克隆細(xì)胞A549/DDP/sh－2.1－1－1和A549/DDP/sh－2.1－2－1抗腫瘤藥的IC50均顯著降低，見(jiàn)表2。

討 論

RNA干擾因其可以高效、特異地抑制靶基因的表達(dá)而迅速成為一種非常有效的在真核細(xì)胞中研究基因功能的工具，從而提供了基因敲除之外的另一種選擇。RNAi作為沉默基因的新方法已成功地用于腫瘤學(xué)的研究，而且siRNAs在極低濃度存在的情況下能特異地封閉mRNA的表達(dá)。夏忠勝等［5］應(yīng)用RNAi技術(shù)，設(shè)計(jì)針對(duì)MDR1 mRNA的siRNAs轉(zhuǎn)入人結(jié)腸癌細(xì)胞中，結(jié)果siRNAs可特異抑制MDR1在mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)，抗癌藥物敏感性增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，siRNAs可特異逆轉(zhuǎn)MDR1介導(dǎo)的耐藥。同樣魏軍民等［6］在乳腺癌細(xì)胞MCF－7/ADR的研究中得到相似結(jié)果。

表2 A549/DDP親本細(xì)胞及其來(lái)源的單克隆細(xì)胞DDP及5－FU的IC50和相對(duì)逆轉(zhuǎn)率Table 2.The IC50and relative reversal rates of A549/DDP cells treated with siRNA for DDP and 5－FU(.n=3)

表2 A549/DDP親本細(xì)胞及其來(lái)源的單克隆細(xì)胞DDP及5－FU的IC50和相對(duì)逆轉(zhuǎn)率Table 2.The IC50and relative reversal rates of A549/DDP cells treated with siRNA for DDP and 5－FU(.n=3)

＊＊P ＜ 0.01 vs A549/DDP or vector control.

Group DDP(μmol/L) 5－FU(μmol/L) DDP reversal rate(%)5－FU reversal rate(%)A549/DDP 101.45 ±0.64 263.20 ±2.00— —Vector control 96.43 ±3.31 247.57 ±5.72 4.97 ±0.12 5.94 ±0.18 sh －2.1 －1 －1 38.06 ±0.05＊＊ 98.82 ±1.16＊＊ 79.35 ±1.86 78.55 ±0.59 sh －2.1 －2 －1 53.72 ±0.36＊＊ 141.81 ±0.49＊＊ 59.74 ±0.64 57.93 ±1.80 A549 21.56 ±0.44 53.30 ±2.52— —

本研究采用RNA聚合酶III U6啟動(dòng)子表達(dá)siRNA分子，采用此方法表達(dá)siRNA分子適合用于進(jìn)行靶基因的表達(dá)受到抑制后細(xì)胞表型的長(zhǎng)期變化觀察，也適于進(jìn)行文庫(kù)的篩選。此方法克服了人工合成或體外轉(zhuǎn)錄的siRNA分子價(jià)格昂貴、基因沉默時(shí)間短、轉(zhuǎn)染效果不穩(wěn)定等問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)MRP1基因表達(dá)序列設(shè)計(jì)有效的RNA干擾片段，在體外構(gòu)建表達(dá)并獲得 MRP1基因特異的 shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體pSilencer 2.1－U6 neo－MRP1，pSilencer 2.1－U6 neo－MRP1表達(dá)載體含有U6啟動(dòng)子和抗G418基因，能在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后用G418進(jìn)行簡(jiǎn)便的篩選。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用電穿孔轉(zhuǎn)染將重組表達(dá)載體穩(wěn)定導(dǎo)入A549/DDP細(xì)胞內(nèi)，與其它技術(shù)相比更易操作，可以對(duì)很廣范圍的動(dòng)物細(xì)胞發(fā)揮作用。

pEGFP－N1質(zhì)粒含有可編碼綠色熒光蛋白基因，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)綠色熒光，通過(guò)熒光多少可以判斷轉(zhuǎn)染效率，采用pEGFP－N1質(zhì)粒優(yōu)化電轉(zhuǎn)染條件，其操作簡(jiǎn)單、快速、直觀、準(zhǔn)確，可以取得較高的轉(zhuǎn)染率。本研究用Sac I線性化酶將重組載體線性化后轉(zhuǎn)染，有利于重組載體整合到宿主細(xì)胞的基因組中，提高了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的水平。本研究通過(guò)G418篩選和有限稀釋法挑取單克隆，得到性能專一的單克隆細(xì)胞A549/DDP/sh－2.1－1－1和A549/DDP/sh－2.1－2－1，將所得單克隆投于液氮中，2個(gè)月后，經(jīng)復(fù)蘇傳代1個(gè)月，實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫熒光檢測(cè)證實(shí)其MRP1 mRNA和蛋白的表達(dá)仍被穩(wěn)定抑制，結(jié)果顯示A549/DDP/sh－2.1－1－1和A549/DDP/sh－2.1－2－1與 A549/DDP細(xì)胞相比，MRP1 mRNA表達(dá)量分別下降到47.89% ±0.00%和55.03% ±0.81%，轉(zhuǎn)染細(xì)胞蛋白表達(dá)量分別下降到83.83% ±1.20%和 48.16% ±0.69%。結(jié)果說(shuō)明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染含編碼MRP1 siRNA的質(zhì)粒載體能長(zhǎng)期穩(wěn)定抑制549/DDP肺癌多藥耐藥細(xì)胞MRP1 mRNA和蛋白的表達(dá)。單克隆細(xì)胞經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的凍存和傳代培養(yǎng)，多藥耐藥逆轉(zhuǎn)效果仍較好，可見(jiàn)本實(shí)驗(yàn)方法可長(zhǎng)期、穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)A549/DDP的多藥耐藥性，恢復(fù)對(duì)化療藥物的敏感性。

本研究結(jié)果初步證明RNA干擾技術(shù)能夠穩(wěn)定、長(zhǎng)期地封閉MRP1基因的表達(dá)，也為進(jìn)一步體內(nèi)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供了可能性。

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