李 明，馬建新，王忠明，侯吉棉，周 杰

江蘇省連云港市第二人民醫(yī)院放療科，江蘇連云港 222023

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7%～10%，全世界每年發(fā)患者數(shù)達130萬例，每年約有50萬人死于乳腺癌。近年來其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，城市中乳腺癌的發(fā)病率為女性惡性腫瘤的第二位，已經(jīng)成為威脅婦女健康的嚴重疾病之一。隨著科技的發(fā)展，在乳腺癌的治療方面雖取得了一定的進展，但仍有較多患者出現(xiàn)復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移等并發(fā)癥[1]。熱休克蛋白（HSP）是一類保守的細胞內(nèi)源性保護蛋白，可以被許多不利的情況包括高溫、缺血、缺氧、重金屬、代謝性毒物等多種應激所誘導，其作用就是保護細胞，參與細胞損傷的修復過程。但熱休克蛋白的表達同時也保護了腫瘤細胞，使得腫瘤細胞的輻射敏感性降低，不利于放射治療。槲皮素又名櫟精、槲皮黃素，早期作為祛痰、止咳、降低血壓、增強毛細血管抵抗力、降血脂等方面的藥物，近年來發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗炎、消除自由基、抑制熱休克蛋白表達等多種生物活性[2]。本實驗主要是利用槲皮素抑制熱休克蛋白的表達來研究乳腺癌MCF-7細胞輻射敏感性的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI 1640培養(yǎng)基（購自Gibco公司）；胰酶（購自Am-resco公司）；小牛血清（杭州四季青產(chǎn)品）；槲皮素（購自Gibco）；BSA（購自 Roche 公司）；Triton X100（購自 Amersharm 公司）；乙醇、Tris堿和氯化鈉（均購自國藥集團）。MTT、Giemsa染劑（美國 Sigma，華美分裝）；SDS、HEPES（購自華美生物工程公司）。倒置相差顯微鏡 OLYMPUS CK40；THERMO FORMA3111 CO2培養(yǎng)箱；光學顯微鏡OLYMPUS CK40；酶標儀BIO-TEK；流式細胞儀 BECKMANCOULTERFC500；血細胞計數(shù)板、96孔板等。

1.2 方法

1.2.1 照射條件 采用西門子PRIMUS型醫(yī)用電子直線加速器產(chǎn)生的6 mV高能X射線照射，照射劑量率為300 cGy/min，源皮距為100 cm，加1 cm厚度組織補償物。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與處理條件 MCF-7細胞采用RPMI 1640培養(yǎng)基加10%的小牛血清在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。選對數(shù)生長期的細胞按處理方式的不同，隨機分為A、B兩組，A組42℃熱休克處理2 h，誘導熱休克蛋白表達，B組熱處理前1 h加入終濃度為 50、100、150 μmol/L的槲皮素， 然后 42℃熱休克處理 2 h。 4 h 后分別用 X 射線 0、2、4、6、8、10、15 Gy輻照后繼續(xù)培養(yǎng)，用于實驗。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖抑制率 選對數(shù)生長期的MCF-7細胞，消化稀釋，用光學顯微鏡計數(shù)儀進行血細胞計數(shù)，計算細胞濃度，調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml，然后接種96孔板，每孔 100 μl，置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。 經(jīng) A、B 組處理條件處理后，分別繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，每孔加入培養(yǎng)基 100 μl，MTT 10 μl（5 g/L），4 h 后除去培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100 μl，振蕩后在酶標儀上570 nm波長處測定吸光度值D，設置6個平行樣，并設空白對照。分別計算槲皮素對MCF-7細胞增殖的抑制率。增殖抑制率=[1-（DB-D空白）/（DA-D空白）]×100%。

1.2.4 細胞克隆形成實驗檢測細胞存活率 取對數(shù)生長期MCF-7細胞制成單細胞懸液，按照射劑量大小將不同密度的細胞接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，均勻分布。隨著照射劑量的增大，相應增加接種的細胞數(shù)。 在照射劑量為 0、2、4、6、8、10 和 15 Gy時，密度分別為 500、500、2000、6000、10000、40000 和 80000個/5 ml。每組每個劑量點設三個平行樣，待細胞貼壁后，經(jīng)A、B組處理條件處理后，8 h后換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10 d。PBS清洗兩遍，甲醇固定 15 min，Gimsa 應用液（1∶9 PBS 液稀釋）染色20 min，計數(shù)50個以上細胞數(shù)的克隆團。根據(jù)公式：細胞存活率SF（%）=B組克隆形成數(shù)/（接種細胞數(shù)×A組克隆形成率）×100%，求得各個時間劑量點存活分數(shù)，繪制出各時間組細胞存活曲線。

1.2.5 流式細胞術AnnexinV/PI雙標法測定細胞凋亡率 取經(jīng)A、B組處理條件處理后的MCF-7細胞，采用流式細胞術Annexin V/PI雙標法來測定細胞凋亡。由于克隆實驗表明槲皮素對X射線照射有增敏作用，且有濃度依賴關系。因此B組細胞在熱處理前選用比較有代表性的150 μmol/L槲皮素處理，然后X射線照射。兩組細胞再培養(yǎng)24 h，用0.25%胰酶消化液制成細胞懸液，用PBS離心洗2次，加入100 μl Binding Buffer 和 FITC 標記的 Annexin-V （20 μg/ml）10 μl，室溫避光反應 30 min，再加入 PI（50 μg/ml）5 μl，避光反應5 min后，加入 400 μl Binding Buffer，立即進行流式細胞術定量檢測。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 所有實驗均重復3次以上，采用SPSS 10.0統(tǒng)計學軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，率的比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTT法檢測不同濃度槲皮素對乳腺癌MCF-7細胞輻射敏感性的影響

MTT法檢測結果顯示，用終濃度為50、100、150 μmol/L的槲皮素作用于MCF-7細胞，可以檢測到在0～8 Gy劑量照射下，B 組（50、100、150 μmol/L）與 A 組不同濃度下槲皮素對MCF-7細胞增殖抑制率的比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P<0.05），并存在濃度依賴關系。10、15 Gy劑量照射時，B組（100、150 μmol/L）與 A 組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 見表1。

表1 不同濃度槲皮素對乳腺癌MCF-7細胞輻射敏感性的影響（±s，%）

表1 不同濃度槲皮素對乳腺癌MCF-7細胞輻射敏感性的影響（±s，%）

注：與A組比較，△P<0.05

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2.2 克隆形成實驗觀測不同濃度槲皮素處理后MCF-7細胞的存活率

MCF-7細胞克隆形態(tài)學觀察，以50個以上的細胞組成為克隆形成的標準。經(jīng) 0、50、100、150 μmol/L 不同濃度槲皮素處理后，X射線照射結果表明，不同濃度的槲皮素處理后，細胞的存活率存在差異，且在實驗的濃度范圍內(nèi)，有一定的濃度依賴關系，濃度越大，對X射線的增敏作用越強。克隆形成實驗的測定結果，見圖1。

2.3 流式細胞術檢測不同濃度槲皮素處理方式下MCF-7細胞的凋亡率

經(jīng)流式細胞術檢測，不加槲皮素處理的A組的MCF-7細胞經(jīng) 0、2、4、6、8、10 Gy 射線照射后的凋亡率分別為（2.31±0.62）%、（10.84±1.37）%、（14.32±0.91）%、（21.68±0.43）%、（28.87±1.02）%和（35.13±0.98）%。處理前加入槲皮素的 B組（150 μmol/L）經(jīng)X 射線照射后的凋亡率分別為（9.87±0.56）%、（17.69±1.63）%、（22.75±0.49）%、（30.16±2.23）%、（41.21±1.30）%和（48.83±1.52）%，A 組和 B 組（150 μmol/L）凋亡率比較，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

圖1 不同濃度槲皮素處理后照射MCF-7細胞存活率

3 討論

槲皮素（Quercetin，Que）是一種黃酮類化合物，化學名為3，3′，4′，5，7-五羥基黃酮， 廣泛分布于自然界各種植物的花、葉、果實之中，具有多種生物活性及藥理作用，如擴張冠狀動脈，降低毛細血管通透性和脆性，抗血小板聚集，抗病毒，抗過敏，鎮(zhèn)痛，抗氧化，清除自由基，抗腫瘤等[3]。國內(nèi)外大量研究證實，槲皮素對前列腺癌、白血病、鼻咽癌、肝癌、胃癌及視網(wǎng)膜母細胞瘤等[4-6]多種腫瘤細胞有抑制增殖的作用，是頗具應用前景的抗癌藥物之一。現(xiàn)在研究顯示槲皮素的抗癌機制主要有：①直接清除活性氧自由基、抑制脂質(zhì)氧化損傷：槲皮素對超氧陰離子（O2-）、羥自由基（-OH）和單線態(tài)氧均有良好的清除作用，其量效關系明顯[7]。②抑制腫瘤細胞增殖：惡性腫瘤細胞的周期調(diào)節(jié)失控，細胞分化受阻，使腫瘤細胞呈過度增殖狀態(tài)，因此調(diào)節(jié)腫瘤細胞周期是槲皮素抗腫瘤作用的機制之一。槲皮素可將腫瘤細胞阻斷在G0/G1、G1/S或G2/M等細胞的各個時期[3]。③誘導細胞凋亡：槲皮素能激活蛋白激酶A、蛋白激酶G，引發(fā)細胞內(nèi)鈣離子升高，從而誘發(fā)凋亡[8]。④對熱休克蛋白和熱休克因子的影響：曾文鋌等[5]利用槲皮素抑制熱休克誘導肝癌HepG2細胞熱休克蛋白70（HSP70）的表達，發(fā)現(xiàn)槲皮素可以在轉(zhuǎn)錄水平上抑制HSP70的表達。⑤參與腫瘤相關基因的調(diào)控：槲皮素可以下調(diào)癌基因（如AKT、C-MYC）、上調(diào)抑癌基因（如P21、P300、P53）而產(chǎn)生抗腫瘤作用[9-10]。⑥逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥機制：槲皮素作為一種廣泛的ATP酶抑制劑，可競爭抑制PgpNBD部分的ATP酶活性，從而抑制Pgp的藥物泵功能，發(fā)揮多耐藥功能[11]。

本研究主要是利用熱休克作用誘導熱休克蛋白表達，并用槲皮素抑制熱休克表達來研究槲皮素對MCF-7細胞輻射敏感性的影響。結果顯示，無論是MTT法檢測細胞增殖，細胞克隆形成實驗檢測細胞存活率，還是流式細胞術檢測細胞凋亡，都說明槲皮素可以對電離輻射起到一定的增敏作用，且在50～150 μmol/L濃度范圍內(nèi)有濃度依賴關系，濃度越大，增敏作用越強，可能與槲皮素抑制熱休克蛋白表達有關，也可能與槲皮素直接誘導細胞凋亡有關。MTT實驗發(fā)現(xiàn)，在照射劑量在2～10 Gy時，槲皮素可以檢測到其增敏作用，但15 GyX射線照射時，槲皮素對MCF-7細胞輻射敏感性的作用與A組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）?？赡茉驗閯┝刻?，掩蓋了這種增敏作用。

綜上所述，槲皮素對熱休克蛋白高表達影響凋亡的腫瘤細胞，槲皮素可以通過抑制熱休克蛋白在蛋白和轉(zhuǎn)錄水平的表達，誘導腫瘤細胞凋亡，可見槲皮素在臨床上有很大的應用價值。通過應用槲皮素，既可誘導腫瘤細胞凋亡產(chǎn)生治療作用，又可打破熱耐受，起到放、化療增敏作用。因此，研究槲皮素對細胞凋亡的影響及作用機制，對于預防和治療一些危害人類健康的重大疾病具有非常重大的理論和實際意義。

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