周玲玲 柳璋璞 梁曉雯 黃 艷 王明艷 方泰惠 周學平

(南京中醫(yī)藥大學江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室,南京210029)

類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一種以累及周圍關節(jié)為主的慢性、反復發(fā)作性、炎癥性自身免疫性疾病。中醫(yī)藥在自身免疫病的治療中具有獨特的優(yōu)勢,課題組結合長期臨床治療RA的經驗,研制了清絡通痹顆粒(Qingluotongbi granule,QLT),其臨床療效確切,對關節(jié)炎大鼠免疫功能、滑膜炎癥和骨質破壞均有良好的改善作用[1-3]。而RA早期即可發(fā)生骨質破壞,前期的研究已證實清絡通痹顆?？筛纳芌A的骨質破壞,但其干預骨質破壞的機制尚不明確。

破骨細胞是RA骨質破壞中的關鍵細胞,破骨細胞是由其前體細胞融合而成的終末細胞,在其分化的過程中受到很多因素的影響,如細胞因子IL-1、IL-6、TNF-α等[4],另外破骨細胞分化因子(Osteoclast differentiation factor/Receptor activator of NF-κB ligand,ODF/RANKL)也是一個關鍵性的因子[5],在免疫系統(tǒng)被激活的狀態(tài)下,炎癥滑膜組織中聚集大量的淋巴細胞,活化的T淋巴細胞可表達RANKL,誘導破骨細胞的分化、成熟和活化,并與滑膜成纖維細胞表面產生的RANKL起著相乘效果促進骨質的破壞[6]。課題組前期的研究也證實RA病人的外周血和滑膜組織均存在RANKL的過度表達[7,8],本課題結合RA滑膜成纖維細胞分泌的細胞因子與破骨細胞分化的關系,采用佐劑性關節(jié)炎大鼠(Adjuvant induced arthritis,AIA)滑膜成纖維細胞與外周血單核細胞共同培養(yǎng),誘生出破骨細胞樣細胞,并在此基礎上探討清絡通痹顆粒干預破骨細胞分化的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠,雄性,180～220克,由南京中醫(yī)藥大學動物中心提供,合格證號:SYXK(蘇)2005-0018。

1.2 藥品與試劑 清絡通痹顆粒(QLT):由南京中醫(yī)藥大學植物藥深加工工程中心提供,含3 g生藥/ml。雷公藤多苷片(TⅡ):浙江得思德制藥有限公司?？ń槊?BCG):北京生物制品研究所。淋巴細胞分離液:中國醫(yī)學科學院生物工程研究所。胰蛋白酶:Amresco公司。Ⅱ型膠原酶,噻唑藍(3-(4,5 dimethylthiazal-zyl)2,5-diphenyltetra-zolium bromide,MTT),巨噬細胞集落刺激因子(Macrophage colonystimulating factor,M-CSF),1,25-(OH)2D3,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)檢測試劑盒:Sigma公司產品。鏈霉蛋白酶 E:Merck公司產品。大鼠 IL-1β,TNF-α,RANKL ELISA檢測試劑盒:ADL公司產品,美國Sigma公司。牙質片層:英國 Immunodiagnostic Systems Linited(IDS Ltd)。Transwell細胞小室:0.4μm膜孔徑的PET板,Corning公司產品。

1.3 主要儀器 680型全自動酶標儀為美國BIO-RAD伯樂公司。3111型CO2培養(yǎng)箱為FORMA SCIENTIFIC產品。IX71相差顯微鏡為Olympus公司產品。

1.4 AIA滑膜成纖維細胞與單核細胞共培養(yǎng)模型的建立

1.4.1 大鼠AIA的誘導及處理 參照文獻[9],制備弗氏完全佐劑(CFA)(其中含BCG 7.5 mg/ml)。30只SD雄性大鼠,大鼠右后足跖皮內注射CFA 0.05 ml/只,另取10只大鼠作為正常對照組,以等體積生理鹽水同部位注射,飼養(yǎng)28天。

1.4.2 AIA大鼠單核細胞的獲取[10]AIA大鼠,取新鮮抗凝血,以淋巴細胞分離液進行分離,移入細胞瓶,培養(yǎng)12小時左右,棄上層淋巴細胞,下層貼壁的為單核細胞。

1.4.3 AIA大鼠滑膜成纖維細胞的培養(yǎng)[11]AIA大鼠處死,分離關節(jié)滑膜組織,加少許 15%NBSDMEM剪碎(1～2 mm3),小心移入培養(yǎng)瓶中,5%CO237℃貼壁4小時,添加少許 15%NBS-DMEM,5%CO237℃繼續(xù)培養(yǎng),每三天更換一次培養(yǎng)液,待長滿培養(yǎng)瓶后傳代。

1.4.4 AIA滑膜成纖維細胞與單核細胞共培養(yǎng)模型的建立[12]24孔板內加入106ml-1單核細胞0.6ml(作為誘導形成破骨細胞的前體細胞),將傳代至3～5代的滑膜成纖維細胞制備成105ml-1細胞懸液0.1 ml,加入24孔培養(yǎng)板內的懸掛式Transwell小室內,加入 M-CSF(1 ng/ml)和 1,25-(OH)2D3(10-7mol/L),置5%CO2培養(yǎng)箱 37℃培養(yǎng),培養(yǎng)3周后 ,參照說明書進行TRAP染色鑒定,倒置顯微鏡下觀察,TRAP+部位呈棕紅色顆粒。

1.5 QLT含藥血清的制備 實驗室以君藥青風藤的成分青藤堿為標準建立了QLT含藥血清的制備方法。SD大鼠40只,雄性,分 5組,每組8只。即①正常對照組;②陽性對照組:TⅡ7.5 mg/kg;③QLT小劑量組3.6 g生藥/kg;④QLT中劑量組7.2g生藥/kg;⑤QLT大劑量組14.4 g生藥/kg。各組按10 ml/kg連續(xù)灌胃給藥,正常對照組給予等體積生理鹽水。連續(xù)給藥7天,末次給藥后1小時取血,離心獲含藥血清。將各組收獲血清混合后56℃30分鐘滅活,分裝,-20℃保存1個月內使用。

1.6 QLT對共培養(yǎng)誘生的破骨樣細胞活性的影響

1.6.1 QLT對共培養(yǎng)誘生的破骨細胞增殖和TRAP活性的影響[13]24孔板內加入107ml-1單核細胞0.6 ml,于懸掛式小室內加入0.1 ml的滑膜成纖維細胞懸液(106ml-1),加入相應濃度的M-CSF和1,25-(OH)2D3,5%CO237℃培養(yǎng) 2周后,加入 1∶10稀釋的不同劑量組的QLT含藥血清和正常對照血清培養(yǎng)48小時,取出Transwell小室,取各孔部分上清,參照試劑盒說明書檢測TRAP活性。在各孔加入5 mg/ml MTT 0.1 ml,4小時后吸棄上清,加入0.5 ml二甲亞砜,酶標儀檢測各孔A值。

1.6.2 QLT對破骨細胞所致骨吸收陷窩面積的影響[14]同前進行單核細胞和滑膜成纖維細胞的共培養(yǎng),5%CO237℃培養(yǎng)2周,以鏈霉蛋白酶E消化下層細胞,配制成104ml-1細胞懸液,加入預置象牙片的96孔板,同時加入 10-8mol/L 1,25-(OH)2D3,培養(yǎng)1周后,加入1∶10稀釋的不同劑量組的QLT含藥血清和正常對照血清培養(yǎng)48小時,取出骨片,掃描電鏡下觀察骨片上破骨細胞生長情況和吸收陷窩的情況,用Leica圖像分析儀系統(tǒng)計算骨吸收陷窩的面積。

1.7 QLT對共培養(yǎng)細胞上清細胞因子水平的影響同前進行單核細胞和滑膜成纖維細胞的共培養(yǎng),5%CO237℃培養(yǎng)2周,加入1∶10稀釋的不同劑量組的QLT含藥血清和正常對照血清培養(yǎng)48小時,取出Transwell小室,收集下層的上清液,ELISA法檢測上清液中IL-1βTNF-α和RANKL的水平。

2 結果

2.1 共培養(yǎng)破骨細胞形態(tài)學觀察 AIA大鼠外周血單核細胞初培養(yǎng)時有一定數目的細菌存在,經雙抗處理后細菌明顯減少至消失,加入培養(yǎng)的AIA大鼠滑膜成纖維細胞至懸掛小室中,細胞很快貼壁生長并連接成片。底層的單核細胞逐漸開始分化,伸出偽足,貼壁生長,約2周左右,形成破骨細胞樣形態(tài),部分細胞成簇生長。3周后細胞形態(tài)變化不明顯,行TRAP染色,細胞胞漿呈棕紅色顆粒狀,核為陰性,核仁清晰。如圖1所示。

圖1 AIA大鼠單核細胞和滑膜成纖維細胞共培養(yǎng)的生長情況及TRAP染色Fig.1 Monocytes of AIA rat was co-cultivated with synovial fibroblasts and TRAPidentification was conducted

2.2 QLT對共培養(yǎng)誘生的破骨樣細胞增殖反應的影響 表1結果顯示,QLT 7.2、14.4 g/kg給藥的大鼠含藥血清均可明顯抑制共培養(yǎng)誘生的破骨樣細胞的增殖,與正常對照組比較差異顯著(P＜0.05)。

2.3 QLT對共培養(yǎng)誘生的破骨樣細胞TRAP活性的影響 表2結果顯示,QLT 3.6、7.2、14.4g/kg給藥的大鼠含藥血清可抑制共培養(yǎng)誘生的破骨樣細胞的TRAP活性,與對照組比較差異顯著(P＜0.05,0.01)。

2.4 QLT對共培養(yǎng)誘生的破骨樣細胞骨吸收的影響 共培養(yǎng)體系中預置骨片進行培養(yǎng),2周后掃描電鏡觀察可見破骨細胞在骨片上貼附生長,伸出片狀或絲狀偽足,骨片上出現(xiàn)大小不等的骨吸收陷窩(圖2)。

表1 QLT含藥血清對破骨樣細胞增殖反應的影響(n=8, ±s)Tab.1 Effects of QLT-containing sera on the growth of the osteo-like cells(n=8±s)

表1 QLT含藥血清對破骨樣細胞增殖反應的影響(n=8, ±s)Tab.1 Effects of QLT-containing sera on the growth of the osteo-like cells(n=8±s)

Note:1)P＜0.05;2)P＜0.01 vs control.

Group Dose(g/kg) Proliferation(A)Control —— 0.53±0.047 TⅡ 7.5 mg/kg 0.31±0.0292)QLT 3.6 0.37±0.0511)QLT 7.2 0.27±0.0382)QLT 14.4 0.18±0.0452)

表2 QLT含藥血清對破骨樣細胞TRAP活性的影響(n=8,±s)Tab.2 Effects of QLT-containing sera on the ability of TRAP of osteo-like cells(n=8, ±s)

表2 QLT含藥血清對破骨樣細胞TRAP活性的影響(n=8,±s)Tab.2 Effects of QLT-containing sera on the ability of TRAP of osteo-like cells(n=8, ±s)

Note:1)P＜0.05;2)P＜0.01 vs control.

Group Dose(g/kg) TRAP(U/L)Control —— 6.89±0.38 TⅡ 7.5 mg/kg 3.15±0.291)QLT 3.6 5.33±0.471)QLT 7.2 3.08±0.282)QLT 14.4 2.64±0.242)

圖2 破骨樣細胞附著骨片掃描電鏡檢查(×800)Fig.2 Scanning electron micrograph of bone resorption of bone wafers on which osteo-like cells were incubated(×800)

表3 QLT含藥血清對破骨樣細胞所致骨吸收陷窩面積的影響(±s)Tab.3 Effects of QLT-containing sera on the resorption areaof osteo-like cells(±s)

表3 QLT含藥血清對破骨樣細胞所致骨吸收陷窩面積的影響(±s)Tab.3 Effects of QLT-containing sera on the resorption areaof osteo-like cells(±s)

Note:1)P＜0.05;2)P＜0.01 vs control.

Group Dose(g/kg) Number(n) Resorption area(μm2)Control —— 4 25.19±5.04 TⅡ 7.5 mg/kg 4 10.25±2.472)QLT 3.6 4 18.66±3.87 QLT 7.2 4 12.21±5.071)QLT 14.4 4 6.16±1.992)

表4 QLT含藥血清對破骨樣細胞培養(yǎng)上清細胞因子水平的影響(±s,n=4)Tab.4 Effects of QLT-containing sera on thelevels of cytokines in supernatants of osteo-like cells ±s,n=4)

表4 QLT含藥血清對破骨樣細胞培養(yǎng)上清細胞因子水平的影響(±s,n=4)Tab.4 Effects of QLT-containing sera on thelevels of cytokines in supernatants of osteo-like cells ±s,n=4)

Note:1)P＜0.05;2)P＜0.01 vs control.

Group Dose(g/kg) IL-1β(pg/ml) TNF-α(pg/ml) RANKL(pg/ml)Control —— 436.00±44.16 151.75±22.87 25.83±4.01 TⅡ 7.5 mg/kg 286.28±43.342) 67.25±14.532) 8.97±1.492)QLT 3.6 322.51±51.391) 97.50±13.831) 18.32±2.14 QLT 7.2 291.88±39.242) 63.75±17.742) 13.13±1.861)QLT 14.4 228.48±37.552) 45.25±7.332) 7.55±0.552)

表3結果顯示,QLT 7.2 g/kg、14.4 g/kg給藥的大鼠含藥血清可抑制破骨細胞所致骨吸收陷窩面積,與對照組比較差異顯著(P＜0.05,0.01)。

2.5 QLT對共培養(yǎng)誘生的破骨樣細胞培養(yǎng)上清細胞因子水平的影響 表4結果顯示,QLT不同劑量給藥的大鼠含藥血清可抑制共培養(yǎng)誘生破骨樣細胞體系的培養(yǎng)上清液中 IL-1β、TNF-α和 RANKL的水平,與對照組比較差異顯著(P＜0.05,0.01)。

3 討論

破骨細胞已成為RA骨質破壞過程中的關鍵性細胞,其過度增殖打破了成骨細胞和破骨細胞之間的平衡狀態(tài),使骨質破壞隨之發(fā)生[15]。因此對破骨細胞的研究成為了解RA骨質破壞機制的關鍵環(huán)節(jié)。

RA的骨質破壞與滑膜炎癥存在密切的聯(lián)系,滑膜細胞分泌的細胞因子可促進破骨細胞的活化,加速骨質破壞的發(fā)生。為了體現(xiàn)RA的病理特點,本課題采用了AIA大鼠滑膜成纖維細胞作為基質細胞,AIA大鼠外周血單核細胞作為破骨細胞前體細胞,成功誘導出破骨細胞樣細胞,其TRAP染色陽性,有骨吸收的能力,具有破骨細胞的一般特征。在誘導過程中,兩種細胞分別獨立培養(yǎng),但培養(yǎng)液可以互通,這提示滑膜成纖維細胞所分泌的細胞因子可刺激破骨細胞前體細胞分化為破骨細胞。因此,這種共培養(yǎng)的方式可以更好地體現(xiàn)RA滑膜炎癥和骨質破壞之間的內在聯(lián)系,適合于RA治療藥物的作用機制研究。

在建立上述共培養(yǎng)誘生破骨樣細胞的模型的基礎上,課題進一步研究了QLT對細胞的影響,結果顯示:QLT含藥血清可以抑制破骨樣細胞的分化增殖,抑制破骨樣細胞的TRAP活性,降低其骨吸收能力,說明QLT可以抑制破骨細胞的分化過程。

現(xiàn)普遍認為IL-1、TNF-α和RANKL等細胞因子是最為重要的正調控因素[16,17],尤其是RANKL,它與其它細胞因子相互影響[5],對破骨細胞進行調控,影響破骨細胞生成、分化、活化的多個環(huán)節(jié)。在RA炎性滑膜組織中,滑膜成纖維細胞可表達RANKL,存在異常的RANKL表達增高。研究發(fā)現(xiàn),RA滑膜中活化的T細胞以及滑膜成纖維細胞能夠產生RANKL,并與局部的骨質侵蝕有關[18,19]。課題組以前的結果顯示AIA大鼠滑膜成纖維細胞可分泌過量的IL-1、TNF-α等,這也提示AIA大鼠滑膜成纖維細胞分泌的細胞因子對破骨細胞分化起到了促進作用,促使單核細胞分化為多核破骨樣細胞。本文的研究結果也顯示:QLT含藥血清可以明顯抑制共培養(yǎng)體系培養(yǎng)上清中IL-1、TNF-α和RANKL的水平,這提示QLT可抑制共培養(yǎng)體系中的細胞因子水平,這可能是其抑制共培養(yǎng)中破骨細胞活化、增殖和活性的機制之一。

上述實驗結果提示:關節(jié)炎大鼠滑膜成纖維細胞和外周血單核細胞共培養(yǎng)可成功誘生出破骨樣細胞,適用于RA骨質破壞的研究;清絡通痹顆粒的含藥血清可以抑制共培養(yǎng)體系中破骨樣細胞的分化和活性,這一作用與其抑制滑膜成纖維細胞分泌過量的細胞因子有關。

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