張春江 楊平榮 王 槐 丁佳棟 (蘭州大學生命科學學院,蘭州 730000)

細胞因子介導的自身免疫是引起自身免疫性疾病的一種重要的機制。白介素17(IL-17)是目前新發(fā)現(xiàn)的細胞因子,IL-17與自身免疫病和炎癥性疾病關(guān)系密切。銜接蛋白ACT1是活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的重要蛋白分子。ACT1在IL-17信號通路中起重要作用,是IL-17和其受體IL-17R以及下游信號傳導之間重要的信號連接分子[1,2]。ACT1經(jīng)SEFIR結(jié)構(gòu)域與IL-17受體結(jié)合,活化TRAF6、TRAF3、TAK1分子,繼而激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,表達相關(guān)細胞因子,從而導致自身免疫疾病和炎癥的發(fā)生[3,4]。ACT1介導的IL-17信號通路誘導類風濕關(guān)節(jié)炎、哮喘、自身免疫性腦脊髓炎、腸炎等自身免疫性疾病的發(fā)生[5-7]。以ACT1與IL-17受體相互作用為原理,阻斷其相互作用為靶點,應(yīng)用酶互補熒光檢測技術(shù),建立以β-內(nèi)酰胺酶報告基因酶互補檢測系統(tǒng)細胞水平的高通量篩選系統(tǒng),篩選針對藥物靶標的抑制劑,從而為治療自身免疫學疾病新藥的研制和開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

本論文以銜接蛋白ACT1與白介素17(IL-17)受體相互作用為原理,阻斷其相互作用為靶點,克隆構(gòu)建ACT1-Bla-A、IL-17R-Bla-B融合基因,融合基因分別在真核細胞系 HEK293中瞬時高效表達,采用熒光顯微鏡,檢測 β-內(nèi)酰胺酶(β-Lactamase)熒光報告系統(tǒng)的酶互補作用。進一步利用對抗性基因的篩選,篩選在Hela細胞系中融合基因共表達的穩(wěn)定真核細胞表達系統(tǒng),獲得細胞水平的以β-內(nèi)酰胺酶為檢測系統(tǒng)的高通量篩選系統(tǒng)。從細胞表達水平高通量篩選有效抑制ACT1與其特異性受體IL-17R相互作用的抑制劑,從而為治療自身免疫學疾病新藥的研制和開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 引物、質(zhì)粒、菌種 引物由Invitrogen公司合成,含有β-內(nèi)酰胺酶(Bla)編碼基因的質(zhì)粒 pGEX,含有neomycin基因的真核表達質(zhì)粒 pcDNA3.1,含有FLAG標記的真核表達質(zhì)粒 pCMV-3FLAG-8.0,含有hIL-17R全長基因的質(zhì)粒 pcDNA3.1;大腸桿菌E.coli DH5α均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 高保真DNA聚合酶(pfu Taq酶)、DNA連接酶,限制性內(nèi)切酶均購自Gibco公司;質(zhì)粒提取試劑盒及PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自QIAGEN;轉(zhuǎn)染用試劑Fugene購自 Invitrogen公司;抗體anti-Flag、anti-HA 、anti-ACt1購自Sigma,G418購自 Amresco公司;Western blot超敏發(fā)光液購自普利萊公司。

1.2 方法

1.2.1 融合基因表達質(zhì)粒pCDNA3.1/HA-hACT1-Bla-A的構(gòu)建 分別擴增HA-hACT1(1698 bp)、(Gly4Ser)5-Bla-A(561 bp)片段,hACT1 5′端引入HA標記,β-內(nèi)酰胺酶 A 片段(Bla-A)5′端引入(Gly4Ser)3連接子。采用ZIPPCR,第一次擴增產(chǎn)物做為模版,二次PCR獲得融合基因HA-hACT1-Bla-A(2 259 bp),TA克隆轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 pCDNA3.1,鑒定融合基因序列的正確性。

1.2.2 融合基因表達質(zhì)粒pCMV-3FLAG-8.0/IL-17R-Bla-B的構(gòu)建 β-內(nèi)酰胺酶 B片段(Bla-B)5′端引入(Gly4Ser)3連接子 (321 bp),PCR擴增,酶切,連接在pcDNA3.1/hIL-17R重組質(zhì)粒上(hIL-17R:2601 bp),獲得融合基因hIL-17R-Bla-B(2 722 bp),轉(zhuǎn)化連接在質(zhì)粒pCMV-3FLAG-8.0,鑒定融合基因序列的正確性。

1.2.3 全長β-內(nèi)酰胺酶表達質(zhì)粒pCDNA3.1/Bla(A+B)構(gòu)建 設(shè)計引物,以 PGE為模板,擴增全長β-內(nèi)酰胺酶基因(792 bp),PCR產(chǎn)物TA克隆轉(zhuǎn)化至質(zhì)粒pCDNA3.1,經(jīng)PCR,DNA 測序分析 ,鑒定β-內(nèi)酰胺酶全長基因的正確性。

1.2.4 應(yīng)用免疫印跡方法確定融合基因在真核細胞中的高效表達 培養(yǎng)細胞HEK293,轉(zhuǎn)染融合基因DNA,48小時后,收獲細胞,加細胞裂解液裂解細胞。離心,收獲上清,上清液保存于-20℃。經(jīng)常規(guī)Western blot法檢測觀察結(jié)果。

1.2.5 確定β-內(nèi)酰胺酶報告基因活性熒光檢測系統(tǒng)酶的互補作用 培養(yǎng)細胞HEK293,兩種融合基因表達載體DNA共轉(zhuǎn)染HEK973細胞。轉(zhuǎn)染24小時后,用修飾的生理鹽水緩沖液洗滌細胞兩次,后加入底物CCF2/AM于室溫放置1小時。經(jīng)生理鹽水洗滌后用熒光顯微鏡(Zeiss Axiovert 100TV)觀察細胞。

1.2.6 穩(wěn)定表達工程細胞株的篩選 24孔細胞板培養(yǎng)Hela細胞,篩選G418濃度,以細胞死亡的最低濃度為篩選濃度。培養(yǎng)Hela細胞 ,加入藥物G418抗性篩選,挑單克隆細胞團,繼續(xù)培養(yǎng),反復篩選,免疫印跡檢測穩(wěn)定表達細胞株。

2 結(jié)果

2.1 融合基因HA-hACT1-Bla-A以及IL-17R、Bla-B片段的獲得 經(jīng)二次PCR獲得融合基因HA-hACT1-Bla-A片段,PCR擴增分別得到IL-17R及Bla-B片段,以及β-內(nèi)酰胺酶全長基因,瓊脂糖凝膠電泳檢測后,證實PCR擴增出了相應(yīng)大小的目的片段。

2.2 重組融合質(zhì)粒雙酶切及測序鑒定 融合基因片段HA-hACT1-Bla-A經(jīng)TA克隆轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pC DNA3.1,得到融合的 HA-hACT1-Bla-A。PCR產(chǎn)物IL-17R及Bla-B片段經(jīng)相應(yīng)雙酶切依次連接到質(zhì)粒pCMV-3FLAG-8.0上,證實獲得IL-17R-Bla-B融合重組質(zhì)粒。Bla全長基因重組質(zhì)粒經(jīng)同樣方法獲得證實。重組質(zhì)粒經(jīng)Invitrogen公司測序后證實DNA序列與GenBank中序列一致(人ACT1序列號147 686人IL-17R序列號014339),表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 Western blot對融合基因在真核細胞中的瞬時高效表達的檢測 ECL顯色后,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組表達質(zhì)粒的HEK293及Pheonix細胞能夠檢測到相應(yīng)大小的蛋白條帶,表明融合基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞中分別獲得成功表達。如圖1所示:融合基因表達質(zhì)粒pCDNA3.1/HA-hACT1-Bla-A分別在Pheonix,HEK 293中得到表達,表達片段大小約為 90 kD。如圖2所示:融合基因表達質(zhì)粒pCMV-3FLAG-8.0/IL-17RBla-B分別在Pheonix,HEK293中得到表達,在130 kD大小處只表達了hIL-17R,在此上方得到融合基因表達條帶。同樣,融合基因表達質(zhì)粒pCDNA3.1/Bla(A+B)分別在Pheonix,HEK293中得到表達。(圖略)。

2.4 β-內(nèi)酰胺酶報告基因活性熒光檢測系統(tǒng)酶的互補作用 兩種融合基因表達載體DNA共轉(zhuǎn)染HEK973細胞后,CCF4-AM底物能夠自由進入細胞,在細胞內(nèi)酶的作用下,分解為CCF2,CCF2能夠雙重激發(fā),在 460 nm 下,香豆素,發(fā)射藍色熒光;在 β-內(nèi)酰胺酶作用下,分解為熒光素,在530 nm下,發(fā)射綠色熒光。熒光顯微鏡檢測底物熒光的變化來判定β-內(nèi)酰胺酶兩個酶片段是否互補,形成完整的β-內(nèi)酰胺酶,發(fā)揮酶活性,使底物降解,發(fā)射藍色熒光。

如圖3所示:A為空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,B為其中一種融合基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,沒有β-內(nèi)酰胺酶活性作用,細胞為綠色熒光。C為兩種融合基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,發(fā)射藍色熒光,說明Act1與IL-17R相互作用,Bla-A與Bla-B片段互補,形成完整的β-內(nèi)酰胺酶。D為β-內(nèi)酰胺酶的基因,說明在細胞中得到有效表達。

2.5 篩選共轉(zhuǎn)染融合基因穩(wěn)定表達細胞系 通過不同濃度G418對Hela細胞生長的影響,最終確定G418篩選濃度為 800 μg/ml。

G418篩選出的單克隆細胞團塊消化下來后,逐級擴大培養(yǎng),經(jīng) Western blot檢測后,沒有得到穩(wěn)定共表達HA-hACT1-Bla-A、hIL-17R-Bla-B融合蛋白的細胞系。

圖1 融合基因質(zhì)粒 pCDNA3.1/HA-hACT1-Bla-A在真核細胞中的表達Fig.1 Expressional analyses of constructs in transiently transfected cells

圖2 融合基因質(zhì)粒 pCMV-3FLAG-8.0/IL-17R-Bla-B在真核細胞中的表達Fig.2 Expressional analyses of constructs in transiently transfected cells

圖3 β-內(nèi)酰胺酶熒光檢測系統(tǒng)酶的互補作用Fig.3 Beta-lactamase complementary assay

3 討論

目前,蛋白質(zhì)互補法(PCA)是最近研發(fā)的一種新型的檢測方法,用于胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的研究。

基于ACT1在IL-17信號傳導途徑中的重要作用和潛在的致病性,決定了其可以作為很好的藥物靶標。應(yīng)用蛋白質(zhì)互補法,以蛋白質(zhì)相互作用,酶片段互補為原理,阻斷其相互作用為靶點,構(gòu)建蛋白分子與酶片段的融合基因,通過檢測酶作用于底物的信號,從而反應(yīng)出體內(nèi)蛋白分子的表達以及相互作用。進而建立高通量藥物篩選系統(tǒng),篩選針對藥物靶標的抑制劑。

β-內(nèi)酰胺酶報告蛋白方法優(yōu)勢在于它是用自由萃滅熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)底物,CCF4-AM,此底物能夠自由進入細胞,在細胞內(nèi)酶的作用下,分解為CCF2。FRET底物能雙重激發(fā),在 460 nm下,香豆素,藍色熒光,530 nm下,熒光素,綠色熒光。這些信號能被熒光分析儀自動讀出并分析,而用于高通量篩選。因為它可以使細胞數(shù)量標準化,減少信號差異,這個方法也能微量化[8,9]。

Lee等[10]成功應(yīng)用β-內(nèi)酰胺酶互補系統(tǒng)高通量篩選了Toll樣受體4(TLR4)的抑制劑,從16 000個化合物中篩選到5個抑制劑。β-內(nèi)酰胺酶技術(shù)最主要的優(yōu)點是其兼容性即實時,非侵害性,克隆篩選的活細胞測量體系。

在本研究中,β-內(nèi)酰胺酶酶片段有效互補,證實hAct1與 hIL-17R的相互作用,為建立針對靶點抑制劑的高通量篩選系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。

在篩選穩(wěn)定表達細胞系時,G418篩選出的單克隆細胞團塊消化下來后逐級擴大培養(yǎng)后,經(jīng)Western blot檢測后,沒有得到表達相應(yīng)大小融合蛋白的穩(wěn)定細胞系。分析原因主要為在構(gòu)建表達質(zhì)粒時,pCDNA3.1/HA-hACT1-(Gly4Ser)3-BLA-A攜帶Neo抗藥性標記,p3FLAG-CMV-8/hIL-17R-linker-Bla-B無篩選標記。經(jīng)G418篩選后,得到的只是針對重組質(zhì)粒 pCDNA3.1/HA-hACT1-(Gly4Ser)3-BLA-A,而不是能夠共表達的。

因此,本文的研究一方面表明:以ACT1與 IL-17R相互作用為靶點,應(yīng)用β-內(nèi)酰胺酶互補系統(tǒng)建立穩(wěn)定表達細胞系,進行高通量篩選是可行的,同時在構(gòu)建融合基因表達質(zhì)粒時,提供了重要的啟示,雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染篩選一定要用兩個抗藥性標記,才能有效篩選得到。由此,在下一步的研究中,選用雙抗藥性篩選標記構(gòu)建融合表達質(zhì)粒,以此構(gòu)建高通量篩選系統(tǒng)。

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