曾 進(jìn)，黃 瑾，呂明莊

(1.深圳龍珠醫(yī)院，廣東 深圳518005;2.江西青峰藥業(yè)有限公司學(xué)術(shù)部，廣東 深圳518034;3.澳門科技大學(xué)醫(yī)院，澳門)

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

青年健康SD雄性大鼠36只，3～4月齡，體重(200±20)g，由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［合格證批號(hào)為SCXK－(黔)2002－0001］。

1.2 藥物及主要試劑

刀豆蛋白A(ConA)和四甲基偶氮唑鹽(MTT)均為Sigma公司產(chǎn)品;IL－2和TNF－α放免試劑盒(天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司);兔抗大鼠IL－2和兔抗大鼠TNF－α試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);PV－6001兔二步法檢測(cè)試劑盒和DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 儀器

550 型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(伯樂(lè)太平洋有限公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(日本)。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

SD雄性大鼠36只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、CFS模型組、艾灸組，每組12只。

1.4.2 造模方法

適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，采用懸吊冷水游泳復(fù)合應(yīng)激因素復(fù)制慢性疲勞動(dòng)物模型，連續(xù)12天［1］。

1.4.3 治療方法

正常組:不做任何治療，每天空抓1次，共12天。模型組:不做任何治療，每天空抓1次，共12天。艾灸組:艾灸穴位肝俞、脾俞、腎俞［2］，隔日1次，每次用艾柱每穴灸1 cm。左右同時(shí)灸，灸6次，共12天。

1.4.4 標(biāo)本采集

治療結(jié)束后，模型組死亡2只，感染2只，死亡原因?yàn)橛斡灸缢?。艾灸組感染2只。剩余大鼠用10%水合氯醛麻醉(100 g/0.3 ml)，剪開腹股溝動(dòng)脈，離心塑料管取血2 ml，臺(tái)式高速離心機(jī)上3 000 r/min離心10 min。吸取血清置于－30℃冰箱保存待測(cè)。

1.4.5 指標(biāo)檢測(cè)

免疫器官指數(shù):將處死后的各組大鼠分別取出胸腺、脾，去除脂肪、筋膜后稱重，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，單位mg/g體重。

脾淋巴細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化能力:采用MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞的增殖情況。無(wú)菌取脾，常規(guī)制成淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度為1.5×106/ml，加入96孔板中，再加入刀豆蛋白A(終濃度為5 μg/ml)，置于CO2培養(yǎng)箱中60 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入MTT，培養(yǎng)結(jié)束后加入二甲基亞楓，于酶標(biāo)儀570 nm處比色測(cè)定吸光度值。

IL－2和TNF－α:采用放射免疫檢測(cè)法(RIA)，按天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司的放免藥盒說(shuō)明書操作。

HE染色觀察大鼠脾臟一般形態(tài)學(xué)變化:將分離取出稱重后脾臟放于10%中性福爾馬林固定24 h，梯度脫水，二甲苯透明、石蠟包埋，切片(3～5 um)，HE病理染色觀察脾臟一般形態(tài)學(xué)變化。

免疫組化測(cè)定:采用PV免疫組化染色法，按北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司藥盒說(shuō)明書操作。

1.4.6 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用Biomias99圖象分析系統(tǒng)對(duì)平均光密度進(jìn)行圖像分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間比較采用單因素方差分析(One－way ANOVE)和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 免疫器官指數(shù) 見表1。

表1 各組大鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)比較(±s)

表1 各組大鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)比較(±s)

注:與正常組比較，ΔP＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05。

2.2 脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化力 見表2。

表2 各組大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化力比較(±s)

表2 各組大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化力比較(±s)

注:與正常組比較，ΔP＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05。

2.3 血清白介素－2(IL－2)和腫瘤壞死因子 －α(TNF－α)濃度值 見表3。

表3 各組大鼠治療后血清IL－2和TNF－α濃度值比較(±s)

表3 各組大鼠治療后血清IL－2和TNF－α濃度值比較(±s)

注:與正常組比較，ΔP＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01;*P＜0.05。

2.4 HE染色結(jié)果

HE染色正常組見圖片1。模型組大鼠脾臟紅髓縮小，白髓萎縮，脾組織內(nèi)脾小梁排列紊亂，中央動(dòng)脈玻變。見圖2a～2b。治療組均有不同程度改善，見圖3。

圖1 正常組大鼠脾臟組織

圖2 a模型組大鼠脾臟組織

圖2 b模型組大鼠脾臟組織

2.5 免疫組化染色結(jié)果 見表4。

表4 各組大鼠IL－2和TNF－α表達(dá)的平均光密度比較(±s)

表4 各組大鼠IL－2和TNF－α表達(dá)的平均光密度比較(±s)

注:與正常組比較，ΔP＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01。

圖3 艾灸組大鼠脾臟組織

3 討論

3.1 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)CFS的認(rèn)識(shí)

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)新認(rèn)識(shí)的一種疾病，由美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心(CDC)于1988年正式命名。這是一種以疲勞為主，伴低熱(或自覺(jué)發(fā)熱)、咽喉痛、肌痛、關(guān)節(jié)痛、頭痛、注意力不易集中、記憶力差、睡眠障礙和抑郁等非特異性表現(xiàn)為主的綜合征［3］。其原因尚不確定，主要有兩種學(xué)說(shuō):生物感染和由感染直接介導(dǎo)的免疫功能失調(diào)［4］。

3.2 免疫與CFS的關(guān)系

很多研究表明［5～6］，CFS患者存在免疫功能的異常，主要表現(xiàn)為細(xì)胞免疫功能低下。此外，還存在淋巴細(xì)胞增殖功能及T細(xì)胞亞群數(shù)目與比值的改變等［7］。因此，有人也將CFS稱為“慢性疲勞免疫功能障礙綜合征”。

3.2.1 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與CFS

脾臟及胸腺是淋巴細(xì)胞的生發(fā)中心，有脾細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)移因子(TF)及胸腺分泌的胸腺素，在免疫疾病防治中具有重要的實(shí)用價(jià)值，因此研究針灸等對(duì)免疫器官重量的影響，可推測(cè)其對(duì)免疫功能的正向調(diào)節(jié)作用。

3.2.2 脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力與CFS

T淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。一般認(rèn)為，機(jī)體的細(xì)胞免疫功能差，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率低;反之，細(xì)胞免疫功能良好，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率也較高。因此，根據(jù)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(增殖指數(shù))的高低，可判斷機(jī)體的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)［8］。

3.2.3 IL－2和TNF－α與CFS

IL－2與CFS:IL－2主要由活化的CD+4T細(xì)胞及少量CD+8T細(xì)胞產(chǎn)生，是一種免疫調(diào)節(jié)淋巴因子。其主要生物學(xué)功能是增強(qiáng)NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的活性，刺激此兩種細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素(γ－INF)，并能誘導(dǎo)IL－1β受體的生成。它有維持T細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)、激活多種免疫細(xì)胞、誘導(dǎo)生成等作用，而且T細(xì)胞產(chǎn)生的IL－2可進(jìn)一步刺激其自身受體的表達(dá)和分泌，其水平反映了T細(xì)胞的功能狀態(tài)，IL－2的產(chǎn)生能力可作為機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)。

TNF－α與CFS:TNF－α是由被激活的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的多膚類介質(zhì)，在體內(nèi)具有廣泛的生物學(xué)作用，可誘導(dǎo)IL－1、IL－6、血小板活化因子(PAF)等細(xì)胞因子參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用。參與了多種疾病的病理過(guò)程，在免疫調(diào)節(jié)、炎癥以及某些慢性病等細(xì)胞反應(yīng)中TNF具有重要作用。有學(xué)者［9～10］對(duì)CFS患者與正常對(duì)照組進(jìn)行了回顧性的對(duì)照研究，發(fā)現(xiàn)CFS患者與對(duì)照組比較TNF呈顯著性升高。

3.3 中醫(yī)學(xué)對(duì)CFS的認(rèn)識(shí)

疲勞在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中多稱為“倦”、“懈惰”、“困薄”、“身重”、“體重”、“四肢不舉”等?！端貑?wèn)·五藏生成論》云:“肝受血而能視，足受血而能步，掌受血而能攝”，指出肝藏血主疏泄的正常功能是人體活動(dòng)能力的重要保證。脾主肌肉四肢，“脾病者身重”，“脾氣虛則四肢不用”。《黃帝內(nèi)經(jīng)》論述“腎足少陰之脈”，“是主腎所生病”，有“嗜臥”之癥?！案髅}者腎也……太過(guò)則令人懈惰”。文獻(xiàn)中疲勞涉及的臟腑主要為肝脾腎三臟，與情志、勞逸、氣血、肝、脾、腎功能失調(diào)有關(guān)。

3.4 艾灸治療CFS的機(jī)理分析

艾灸的防病、治病與保健養(yǎng)生作用在古醫(yī)籍中早有記載。如《本草綱目》曰:“艾，外用灸百病，壯元陽(yáng)，通經(jīng)脈，行氣補(bǔ)血?！彼巍じ]材在《扁鵲心書·住世之法》中就有“保命之法，灼艾第一”之說(shuō)。艾灸對(duì)非特異性免疫和特異性免疫功能都有一定的調(diào)節(jié)作用。在治療與免疫相關(guān)疾病過(guò)程中，艾灸具有抗感染、抗自身免疫病、抗過(guò)敏反應(yīng)、抗癌和延緩衰老等作用，這主要是通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)失衡的免疫功能實(shí)現(xiàn)的［11］。艾灸對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用也是雙重的，既能使紊亂的免疫功能向正常狀態(tài)調(diào)整，也能使正常機(jī)體的抗病能力增強(qiáng)，這種調(diào)節(jié)不僅體現(xiàn)在細(xì)胞水平，而且體現(xiàn)在分子水平。艾灸治療慢性疲勞大鼠未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:艾灸能使慢性疲勞大鼠脾臟指數(shù)提高、脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力增強(qiáng)、血清IL－2和TNF－α小劑量增加，從而提高了免疫功能，這也可能是艾灸治療慢性疲勞綜合征的機(jī)制之一。當(dāng)然，艾灸對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)還表現(xiàn)在更多方面和更深層次，有待今后作進(jìn)一步的研究。

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