陳素輝，孫 華△，徐 虹，黃艷秋，高 揚(yáng)△

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院，北京100730;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京100005)

缺血性腦血管病屬于中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，由于陰陽失調(diào)、氣血逆亂，導(dǎo)致腦脈痹阻。主要的病理生理過程為局部腦血流中斷導(dǎo)致大腦組織的葡萄糖和氧供應(yīng)缺乏，進(jìn)而引起神經(jīng)元的不可逆損傷，主要的損傷機(jī)制包括興奮性神經(jīng)毒性、氧化應(yīng)激和炎癥損傷［1］。針刺在治療缺血性腦血管病方面取得了一些成績，根據(jù)中醫(yī)經(jīng)絡(luò)理論，百會穴屬督脈要穴，歸屬于腦，起通達(dá)陰陽脈絡(luò)、連貫周身經(jīng)穴、調(diào)節(jié)機(jī)體陰陽平衡的作用;足三里穴是足陽明胃經(jīng)的合穴，具有補(bǔ)中益氣、通經(jīng)活絡(luò)等作用，兩穴合用可疏經(jīng)活絡(luò)、扶正祛邪以調(diào)節(jié)機(jī)體陰陽平衡。研究發(fā)現(xiàn)針刺百會和足三里穴能夠抑制腦缺血再灌注區(qū)基質(zhì)金屬蛋白酶－9(MMP－9)及細(xì)胞間黏附分子－1(ICAM－1)等炎癥損傷相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，減少缺血再灌注后的腦組織損傷，保護(hù)腦組織［2］。此外，針刺還可改善缺血病灶區(qū)域的能量供應(yīng)及代謝功能，減輕缺血再灌注后神經(jīng)元細(xì)胞壞死、凋亡過程，具有良好的抗氧化應(yīng)激和腦保護(hù)作用［3］。

外周血是機(jī)體宏觀調(diào)節(jié)信號的有效載體，本研究擬應(yīng)用表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(surface enhanced laser desorption/ionization－time of flight－mass spectrometry，SELDI－TOF－MS)觀察針刺對腦缺血再灌注損傷大鼠外周血清蛋白表達(dá)譜的變化，以探討針刺治療對腦缺血再灌注損傷調(diào)節(jié)機(jī)制的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康SD大鼠，清潔級，雄性，10～12周齡，體重280～310 g，由中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動物中心提供。分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為室溫(25±3)℃，濕度75%，光照:黑暗=12∶12 h，自由攝取飼料和水。

1.2 主要試劑和器材設(shè)備

弱陽性離子交換劑(WCX)納米磁珠試劑盒(北京賽爾迪公司);NP－20芯片校正質(zhì)譜儀、Biomarker Wizard Version 3.1.0軟件、WCX－2芯片(Ciphergen公司);渦旋混合器MVS－1(北京北德科學(xué)器材有限公司);長城牌KWD－808Ⅱ全能脈沖電療儀(常州市武進(jìn)長城醫(yī)療器械有限公司);2636－4A、2634－4A線栓(北京沙東生物技術(shù)公司)。

1.3 腦缺血再灌注損傷模型制備和神經(jīng)功能評分

根據(jù)Longa等［4］的線栓法制備MCAO模型。插栓2 h后拔出線栓以實(shí)現(xiàn)腦缺血再灌注，待大鼠蘇醒后對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，以判斷造模成功與否。

神經(jīng)功能評分法參照Bederson等［5］的5級分類法:0級:無神經(jīng)功能缺損;1級:不能完全伸展左前肢;2級:左前肢屈曲，向左側(cè)推動時(shí)阻力下降;3級:爬行時(shí)向左側(cè)劃圈;4級:意識不清，包括24 h內(nèi)死亡。評分為0級和4級的剔除實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)的分組與處理

采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)將實(shí)驗(yàn)大鼠分為模型組、假手術(shù)組和電針組3個(gè)大組。每大組再按照缺血再灌注后時(shí)間分成12 h、24 h、48 h、72 h、96 h和144 h共6個(gè)亞組，每個(gè)亞組有大鼠7只;另設(shè)正常對照組7只。正常對照組既不手術(shù)也不治療;模型組為造模術(shù)成功后不做治療;假手術(shù)組僅模擬手術(shù)過程，但不插入線栓，不治療;針刺組為造模成功后，依據(jù)華氏大鼠穴位圖譜，針刺百會和足三里穴，針柄連接脈沖電療儀，疏密波，刺激強(qiáng)度為2 mA，頻率2～100 Hz，每日1次，每次20 min。

1.5 SELDI血清樣品的提取

取血清:各組大鼠按照規(guī)定時(shí)間點(diǎn)用4%戊巴比妥腹腔注射麻醉，切開胸腔，心臟取血，室溫下靜置2 h，離心20 min，分離血清，存放于 －80℃冰箱中備用。

分離蛋白:取10 μl血清，加入20 μl U9緩沖液，將樣品冰浴振蕩30 min;加入360 μl WCX－2 buffer液，混勻。取出WCX－2芯片，將芯片插入生物芯片處理器，每孔加200 μl WCX－2 buffer液，置于振蕩器震蕩5 min后甩掉緩沖液;重復(fù)上述操作1次，在甩掉緩沖液后，將100 μl處理好的樣品加入芯片處理器的各個(gè)孔中，并震蕩1 h;甩出樣品，每孔加入200 μl WCX－2 buffer，室溫振蕩5 min后甩去孔中液體，再次加200 μlWCX－2 buffer入各孔中，重復(fù)操作1次。每孔加入200 μl HEPES(1Mm，PH 4.0)液，立即甩出，取出芯片，風(fēng)干后，立即加0.5 μl SPA飽和溶液入每個(gè)加樣孔中 ，待其全干后，再加入0.5 μl SPA液。

1.6 數(shù)據(jù)的讀取與分析

芯片全干后上機(jī)測定。參數(shù)設(shè)置:激光強(qiáng)度205，檢測敏感度8，優(yōu)化分子質(zhì)量范圍為1 000～15 000 Da，最高分子質(zhì)量為50 000 Da。

采用Biomarker Wizard Version 2.1.0軟件分析處理所有數(shù)據(jù)，分析所有1 000～50 000 Da之間的蛋白峰，并計(jì)算出峰的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。用Mann－Whitney U檢驗(yàn)比較配對樣本的蛋白峰，計(jì)算P值。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)各組大鼠血清蛋白差異峰數(shù)量與時(shí)間分布

實(shí)驗(yàn)各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的血清SELDI－TOFMS技術(shù)分析結(jié)果顯示，在1000～50 000 Da范圍內(nèi)，針刺組與模型組、模型組與正常組、模型組與假手術(shù)組比較，可見顯著性差異信號峰表達(dá)。見圖1。

模型組與正常組比較有150個(gè)顯著性差異信號峰(P＜0.05)，包括62個(gè)正向峰(其中12 h組有5個(gè)，24 h組有18個(gè)，48 h組有17個(gè)，72 h組有11個(gè)，96 h組有10個(gè)，144 h組有1個(gè))和88個(gè)負(fù)向峰(6個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別為7、18、20、21、12、10個(gè))。差異峰分布的時(shí)間特征呈鐘形偏正態(tài)分布，峰值時(shí)間為48 h。

圖1 實(shí)驗(yàn)各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清蛋白差異峰分布趨勢圖

模型組與假手術(shù)組比較有78個(gè)顯著性差異信號峰，包括33個(gè)正向峰和45個(gè)負(fù)向峰，其中12 h組有11個(gè)，24 h組有2個(gè)，48 h組有36個(gè)，72 h組有18個(gè)，96 h組有9個(gè)，144 h組有2個(gè)。差異峰分布的時(shí)間特征符合損傷信號表達(dá)的一般規(guī)律，呈雙峰型，第一峰峰值時(shí)間為12 h，第二峰峰值時(shí)間為48 h。

針刺組與模型組比較有89個(gè)差異信號峰，包括32個(gè)正向峰(其中12 h組有2個(gè)，24 h組有12個(gè)，48 h組有2個(gè)，72 h組有8個(gè)，96 h組有7個(gè)，144 h組有1個(gè))和57個(gè)負(fù)向峰(6個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別為9、10、5、16、15、2個(gè))。差異峰分布的時(shí)間特征仍然呈雙峰型，干預(yù)使第一峰峰值時(shí)間后移為24 h，第二峰峰值時(shí)間后移為72 h。

2.2 實(shí)驗(yàn)大鼠血清蛋白差異峰表達(dá)特征

大鼠血清蛋白差異峰表顯示同一質(zhì)荷比的蛋白差異峰在相同時(shí)間點(diǎn)的同一實(shí)驗(yàn)組中的峰形和峰值基本相似，實(shí)驗(yàn)各組間的差異多表現(xiàn)為峰值的大小不同，如圖2A;不同質(zhì)荷比的蛋白差異峰的最大表達(dá)峰值時(shí)間點(diǎn)不同，可出現(xiàn)在損傷早期12 h～24 h，損傷中期48 h～96 h或96 h以后，還可以表現(xiàn)為雙峰形，見圖2B。

2.3 針刺干預(yù)對實(shí)驗(yàn)大鼠血清蛋白表達(dá)譜的影響

針刺干預(yù)對實(shí)驗(yàn)大鼠血清蛋白各組分表達(dá)的影響不同，可表現(xiàn)為單純的抑制或促進(jìn)，如圖3A、圖3B。也可表現(xiàn)為抑制第一峰，使第二峰表達(dá)的高峰時(shí)間前移，如圖3C，示針刺干預(yù)顯著下調(diào)第一峰值，并使第二峰表達(dá)時(shí)間提前到72 h;或者如圖3D，針刺干預(yù)早期以抑制為主，中后期以促進(jìn)為主。

圖2 A模型組(M)、針刺組(D)和假手術(shù)組(J)24 h時(shí)間點(diǎn)4 600 Da血清蛋白質(zhì)譜圖

圖2 B模型組血清中不同質(zhì)荷比蛋白差異峰的峰值時(shí)間分布

圖3 A模型組和針刺組大鼠1 151 Da血清蛋白表達(dá)趨勢圖

3 討論

腦缺血再灌注損傷模型的病理生理機(jī)制主要模擬損傷和損傷－修復(fù)兩個(gè)損傷相關(guān)信號傳導(dǎo)過程。損傷信號鏈主要由炎癥細(xì)胞介導(dǎo)，腦缺血再灌注24～48 h達(dá)到峰值。損傷早期，血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞受到血液流變學(xué)和缺血影響后釋放大量炎癥信號，介導(dǎo)大量炎癥細(xì)胞的募集和細(xì)胞因子、趨化因子、粘附因子等炎癥相關(guān)因子的釋放［6］，導(dǎo)致?lián)p傷局部炎癥細(xì)胞浸潤，進(jìn)一步加重缺氧直接造成的神經(jīng)元壞死和凋亡，使缺血損傷區(qū)域進(jìn)一步擴(kuò)大。炎癥細(xì)胞造成機(jī)體損傷的同時(shí)，免疫系統(tǒng)的反饋調(diào)節(jié)信號，如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、白細(xì)胞介素－10(IL－10)等啟動了損傷－修復(fù)信號鏈［7］。參與損傷－修復(fù)網(wǎng)絡(luò)功能的細(xì)胞主要涉及神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞［8］，信號包括炎性細(xì)胞因子、抗炎性細(xì)胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子。由于損傷程度不同，此期一般在損傷后的48～72 h被觀察到，主要是局部炎癥細(xì)胞功能下調(diào)，損傷－修復(fù)相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)元功能活動上調(diào)，表達(dá)和釋放大量抗炎性細(xì)胞因子，可呈現(xiàn)第2個(gè)損傷局部信號高峰。

圖3 B模型組和針刺組大鼠8 106 Da血清蛋白表達(dá)趨勢圖

圖3 C模型組和針刺組大鼠7 886 Da血清蛋白表達(dá)趨勢圖

圖3 D模型組和針刺組大鼠4 904 Da血清蛋白表達(dá)趨勢圖

外周血是機(jī)體宏觀調(diào)節(jié)信號的最有效載體之一，腦缺血再灌注損傷模型模擬局部腦組織損傷、血流恢復(fù)后相關(guān)信號的傳遞過程，它不僅能反映損傷局部的變化，而且能反映機(jī)體對損傷－應(yīng)激和損傷－修復(fù)產(chǎn)生的全身性應(yīng)答情況，分析血清中相關(guān)信號的變化可以反映局部損傷和損傷－修復(fù)相關(guān)情況的變化，筆者對實(shí)驗(yàn)各組大鼠外周血清樣本進(jìn)行分析的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［9］。

針刺機(jī)制研究已經(jīng)證明針刺可調(diào)節(jié)機(jī)體的神經(jīng)－生理功能，通過神經(jīng)－免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)干預(yù)疾病的病理生理過程。本研究觀察到針刺治療可多點(diǎn)干預(yù)腦缺血再灌注損傷模型大鼠血清蛋白表達(dá)譜的變化，有僅單純的抑制血清中損傷相關(guān)蛋白峰的表達(dá)，或促進(jìn)修復(fù)相關(guān)蛋白峰的表達(dá)，或者抑制早期損傷相關(guān)蛋白的同時(shí)，也促進(jìn)后期修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá)。筆者的結(jié)果表明針刺百會和足三里穴可能通過上調(diào)和下調(diào)腦缺血再灌注損傷大鼠外周血中相關(guān)蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)損傷和損傷－修復(fù)相關(guān)的神經(jīng)－免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，干預(yù)腦缺血再灌注模型大鼠的病理生理過程。

［1］Espinoza－Rojo M，Iturralde－Rodríguez KI，Chánez－Cárdenas ME，et al.Glucose transporters regulation on ischemic brain:possible role as therapeutic target［J］.Cent Nerv Syst Agents Med Chem，2010，10(4):317－325

［2］徐虹，洪禮傳，黃艷秋，等.針刺對腦缺血再灌注模型大鼠腦組織基質(zhì)金屬蛋白酶、細(xì)胞間黏附分子表達(dá)的影響［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，30(7):731－736

［3］沈梅紅，李忠仁，項(xiàng)曉人，等.電針對腦缺血再灌注大鼠大腦皮層超微結(jié)構(gòu)的影響［J］.針刺研究，2009，34(3):167－170

［4］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84－91

［5］Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M.Ratmiddle cerebralartery occlusion:Evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17(3):472－476

［6］A.Denes，P.Thornton，N.J.Rothwell，et al.Inflammation and brain injury:acute cerebral ischaemia，peripheral and central inflammation［J］.Brain Behav Immun.，2010，24(5):708－723

［7］Ekdahl CT，Kokaia Z，Lindvall O.Brain inflammation and adult neurogenesis:the dual role of microglia［J］.Neuroscience，2009，158(3):1021－1029

［8］Mergenthaler P，Dirnagl U，Meisel A.Pathophysiology of stroke:Lessons from animal models［J］.Metabolic Brain Disease，2004，19(3－4):151－167

［9］Hiroshi Yao，Tatsuo Nakahara，Nobuaki Nakagawa，et al.Regional and Temporal Changes in Proteomic Profile after Middle Cerebral Artery Occlusion with or without Reperfusion in Rats［J］.Neurochem Res，2009，34(11):1999－2007