陳保華，黃 榮，姚 斌，毛 英(解放軍第184醫(yī)院外二科，鷹潭 335000)

臟器的保存是移植外科的3大支柱之一，獲取新鮮和高質(zhì)量的供肝是保證肝移植成功的先決條件。自18世紀(jì)至今，廣大學(xué)者一直在研究既經(jīng)濟(jì)又實用的對供肝灌洗保存具有良好保護(hù)作用的藥物。目前漢防己甲素(TET)對肝臟的保護(hù)作用日益受到重視，但尚未見TET在低溫灌洗保存下對肝臟作用的研究報道，本實驗選擇SD大鼠，以4℃的TET溶液直接灌洗等方式保存供肝，以觀察TET在大鼠供肝低溫灌洗保存中對肝細(xì)胞鈣超載及肝功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

采用成年健康SD大鼠80只，雌雄不拘，體重(250±10)g，由中科院實驗動物中心提供，等級SPF，合格證號:0034376，許可證號:SCXK(滬)2009—0006。以完全隨機(jī)設(shè)計方法分成4組，A組(對照組)不注射藥物，以4℃乳酸林格液進(jìn)行供肝灌洗后再以該液保存。B組(TET注射組)術(shù)前24及2 h腹腔內(nèi)注射TET(10 mg·kg－1，杭州康恩貝藥廠出品)，以4℃乳酸林格液進(jìn)行供肝灌洗后再以該液保存。C組(TET灌洗組)術(shù)前24及2 h腹腔內(nèi)注射TET(10 mg·kg－1)，以4℃乳酸林格液中加入TET(30 mg·L－1)進(jìn)行供肝灌洗后再以該液保存。D組(Collins組)不注射藥物，以4℃ Collins液進(jìn)行供肝灌洗后再以該液保存。各組供肝低溫保存時間均為4 h。

1.2 實驗方法

實驗前12 h動物禁食，自由進(jìn)水。乙醚麻醉后取仰臥位，腹部弧型切口，順時針分離肝下腔靜脈、右腎靜脈、右三角韌帶及鐮狀韌帶，結(jié)扎左膈靜脈，行膽總管插管引流，肝動脈結(jié)扎離斷，游離出門靜脈遠(yuǎn)端并予結(jié)扎，然后經(jīng)門靜脈插管并持續(xù)滴注法行供肝原位底壓重力灌洗。同時剪開肝下腔靜脈，邊灌注邊放血，至肝顏色變淡呈均勻土黃色，即取下肝臟置于保存液中保存。

1.3 標(biāo)本收集及測試方法

1.3.1 肝功能檢測:分別取各組的保存液2 mL，檢測肝功能。取保存液前，用注射器抽取5 mL保存液，緩慢沖洗肝臟，然后將保存液搖均，取樣檢測。各組取樣本20 μL，分別加入丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑300 μL和乳酸脫氫酶(LDH)試劑300 μL(上海長征試劑公司產(chǎn)品)，測定波長為340 nm，應(yīng)用日本7150型全自動生化分析儀檢測。

1.3.2 肝細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的檢測:(1)肝細(xì)胞懸液制備:取肝組織約2 g置于4℃1640培養(yǎng)液中，冰浴下剪切成約1 mm×1 mm×1 mm大小，動作須輕柔，用200目尼龍網(wǎng)過濾，低溫離心(4 000 r·min－1)15 min。去上清液后加1640培養(yǎng)液1 mL混勻成懸液備用。(2)試劑:Fura-2/AM粉劑及DMEM均購自Sigma公司;小牛血清購自上海生化所，其他試劑均為分析純。(3)儀器:AR-CM-MIC陽離子測定儀(美國SPEX公司生產(chǎn))，離心機(jī)、恒溫孵箱、倒置顯微鏡(Olymphas公司生產(chǎn))。(4)肝細(xì)胞懸液處理:吸取0.1 mL制備好的肝細(xì)胞懸液，然后加上小牛血清、無鈣Krebs緩沖液及Fura-2/AM，于30℃溫孵35～40 min，負(fù)載后，用無鈣Krebs緩沖液洗脫 2 次，分別以 4 000 r·min－1離心 15 min，棄上清液，加入無鈣緩沖液后即制成肝細(xì)胞懸液。然后取懸液置于載玻片上，通過樣品選擇窗口來選擇樣品中的單細(xì)胞測定，激發(fā)光波長分別為340、380 nm，發(fā)射光波長為505 nm，采樣間隙為1.0 s，連續(xù)記錄細(xì)胞的熒光強度得出F340 nm/F380 nm的比值。使用DM 3000軟件，肝細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度按下式計算:([Ca2+]i):[Ca2+]i=Kd×(Fo/Fs)×(R －Rmin)/(Rmax－R)。

1.4 病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)觀察

(1)光鏡觀察:取肝臟組織1 cm ×1 cm ×1 cm，100 g·L－1甲醛固定，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察攝片。(2)電鏡下觀察:取肝組織約 1 mm ×1 mm ×1 mm，20 g·L－1戊二醛固定，用枸緣酸鉛溶液染色，在PHILIPS EM-400透射電鏡下觀察攝片。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組中ALT、LDH含量及肝細(xì)胞內(nèi)鈣濃度比較

B、C 2組與A組比較，前2組中ALT、LDH含量及Ca2+濃度顯著較A組低，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示TET具有減輕低溫灌洗保存下肝細(xì)胞的鈣超載并保護(hù)肝功能的作用;B、C 2組比較，C組ALT、LDH含量及Ca2+濃度顯著較A組低，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示用TET溶液直接灌洗保存供肝比TET腹腔注射保存供肝在減輕低溫灌洗保存下肝細(xì)胞的鈣超載和保護(hù)肝功能方面效果更好。C、D 2組各指標(biāo)間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，提示用TET溶液灌洗并保存供肝4 h與Collins液灌洗保存組效果相近。各組中ALT、LDH含量及肝細(xì)胞內(nèi)鈣濃度測定結(jié)果見表1。

表1 各組中ALT、LDH含量及肝細(xì)胞內(nèi)鈣濃度測定結(jié)果Tab 1 ALT and LDH contents and Ca2+density within liver cells of each group

2.2 超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

各組肝組織在光鏡下觀察可見:C、D 2組可見中央靜脈周圍肝細(xì)胞輕度腫脹外，其余未見明顯異常;B組可見中央靜脈周圍肝細(xì)胞腫脹，匯管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞濁腫、顆粒變性;A組除上述所見加重外，還可見肝細(xì)胞間連接松解、出現(xiàn)裂隙，肝小葉灶性肝細(xì)胞退變、壞死。各組肝組織在電鏡下觀察可見:各組肝細(xì)胞的線粒體腫脹、嵴排列紊亂、模糊、基質(zhì)淡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等變化，A組最為嚴(yán)重，B組次之，C、D 2組明顯減輕。

3 討論

TET為中藥提取物，又稱粉防己堿，是我國研制的一種鈣通道阻滯劑，作用類似維拉帕米[1-3]，其藥理作用非常廣泛，除有利水消腫、抗菌消炎、抗腫瘤的作用外，研究表明[4]TET能顯著改善肝功能，減輕肝臟病理損傷程度，抑制肝臟細(xì)胞外間質(zhì)合成;并可減少自由基的產(chǎn)生和糾正SOD等的生成不足[4]。雖然目前尚未見TET對低溫灌洗保存肝臟的作用研究的報道，但據(jù)上述理論推斷TET對低溫灌洗保存供肝可能有積極的作用。

本實驗選擇SD大鼠，以4℃的TET溶液直接灌洗等不同的給藥方式灌洗并保存供肝，分別測定肝細(xì)胞內(nèi)鈣值及檢測肝功能和進(jìn)行組織學(xué)檢查，并與Collins液灌洗保存組相比較，以觀察TET在低溫灌洗保存中對大鼠供肝的保護(hù)作用。肝功能檢測和肝臟病理學(xué)檢查結(jié)果表明，使用TET后，與肝功能有關(guān)的酶學(xué)指標(biāo)與未用者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，病理損害也較之明顯減輕，尤其在C組，這種差異更為明顯，說明TET對低溫灌洗保存下的肝臟有保護(hù)作用，可保護(hù)肝細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)，防止肝細(xì)胞腫脹和變性，保護(hù)肝功能。實驗也表明，用TET溶液直接灌洗保存供肝比TET腹腔注射給藥保存供肝，在減輕低溫灌洗保存下肝細(xì)胞的鈣超載和保護(hù)肝功能方面效果更好，可能是因為通過門靜脈系統(tǒng)灌注TET，可使其更廣泛均勻地分布于肝臟中，藥理作用得以充分發(fā)揮，在肝臟保存的冷缺血期，這種保護(hù)作用對減輕保存損傷尤顯重要。

TET能顯著性地減輕低溫灌洗保存下肝細(xì)胞的鈣超載從而對肝功能具有保護(hù)作用，直接灌洗保存供肝比TET腹腔注射給藥效果好，TET對供肝的灌洗保存有積極的作用，因此推斷該藥有望用于臨床供肝的保存。

[1]劉東舉，崔 宏，崔桂英，等．鈣通道阻滯劑對低溫保存大鼠肝臟的保護(hù)作用[J]．中華器官移植雜志，2001，22(2):94.

[2]張 浩，王學(xué)浩，張 峰．鈣離子阻滯劑在肝臟灌洗保存的保護(hù)作用[J]．中華器官移植雜志，2000，21(1):58.

[3]Haddad P，Cabrillac JC，Piche D，et al．Changes in intracellular calcium induced by acute hypothermia in parenchymal，endothelial，and Kupffer cells of the rat liver[J]．Cryobiology，1999，39(1):69.

[4]韓聚強，胡 聰，劉樹賢，等．復(fù)方中藥體外保護(hù)肝細(xì)胞的機(jī)制[J]．世界華人消化雜志，2001，9(8):902.