陸娟，陳建玲

(湖北省襄陽市食品藥品檢驗所，441021)

消癌平片是一種抗癌、消炎、平喘藥，主要成分是烏骨藤，臨床多用于食道癌、胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤。本品具有一定的抑菌作用，用常規(guī)方法對其進行微生物限度檢查時，結(jié)果不能真實反映樣品的污染情況。按《中華人民共和國藥典》2010年版規(guī)定，在進行微生物限度檢查時，應(yīng)對所用方法進行驗證，以確認所采用的方法適合該產(chǎn)品，準確有效地檢出樣品中污染的微生物［1］。按照《中國藥品檢驗標準操作規(guī)范》［2］及參考有關(guān)文獻［3-6］，筆者采用培養(yǎng)基稀釋法進行驗證，報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 立式滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)，HTY-761型勻漿儀(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司)，202-2型電熱恒溫干燥箱(上海浦東躍欣科學儀器廠)，SPX-150生化培養(yǎng)箱(慧科電子有限公司)，生物安全柜(蘇凈安泰)。

1.2 菌種 大腸埃希菌［CMCC(B)44102］，金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］，枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501］，白念珠菌［CMCC(F)98001］，黑曲霉［CMCC(F)98003］。

1.3 培養(yǎng)基及稀釋劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基(BL)、膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基，以上均由北京三藥科技開發(fā)公司提供。含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，0.9%滅菌氯化鈉溶液，pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，新配。

1.4 供試品 消癌平片(湖北創(chuàng)力藥業(yè)有限公司，批號:20101101，20101201，20110101)。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備

2.1.1 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液 取營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 h;用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每毫升含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液。

2.1.2 白念珠菌菌液 取新鮮培養(yǎng)物接種于改良馬丁培養(yǎng)基23～28℃培養(yǎng)24～48 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每毫升含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液。

2.1.3 黑曲菌液 取新鮮培養(yǎng)物，接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)5～7d，用含0.05%聚山梨酯80的無菌0.9%氯化鈉溶液8mL將孢子洗脫，吸出孢子懸液至無菌試管中，用含0.05%聚山梨酯80的無菌0.9%氯化鈉溶液稀釋制成每毫升含孢子50～100 cfu的孢子懸液。

2.2 供試液制備 取供試品10 g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至 100mL，用勻漿儀以2 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)30 s，制備成1∶10的供試液。

2.3 回收率測定

2.3.1 實驗組 常規(guī)法:取供試液和實驗菌液各1mL，分別注入平皿，立即傾入相應(yīng)培養(yǎng)基，搖勻待凝固后按規(guī)定條件培養(yǎng)，每日觀察計算菌落數(shù)，每種實驗菌平行制備2個平皿，結(jié)果見表1。

培養(yǎng)基稀釋法:取供試液0.2mL和實驗菌液1mL分別注入平皿，立即傾入相應(yīng)培養(yǎng)基，搖勻待凝固后按規(guī)定條件培養(yǎng)，每日觀察計算菌落數(shù)，每種實驗菌平行制備10個平皿，結(jié)果見表2。

2.3.2 菌液組 取上述實驗菌液按常規(guī)法測定每一種菌株所加的實驗菌數(shù)。

2.3.3 供試品對照組 常規(guī)法:取供試液1mL注入平皿，立即傾入相應(yīng)培養(yǎng)基，搖勻待凝固后按規(guī)定條件培養(yǎng)，每日觀察計算菌落數(shù)，每種實驗菌平行制備2個平皿，結(jié)果見表1。培養(yǎng)基稀釋法:取供試液0.2mL注入平皿，立即傾入相應(yīng)培養(yǎng)基，搖勻待凝固后按規(guī)定條件培養(yǎng)，每日觀察計算菌落數(shù)，每種實驗菌平行制備10個平皿，結(jié)果見表2。

2.3.4 稀釋劑對照組 用相應(yīng)稀釋劑代替供試液加入實驗菌，使菌液最終濃度為50～100 cfu·mL－1按實驗組方法進行菌落計數(shù)。

2.3.5 結(jié)果判斷 回收率(%)=(實驗組平均菌落數(shù)－供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)×100%。

2.4 控制菌檢驗驗證

2.4.1 實驗組 取1∶10供試液10mL接種至100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，同時加入50～100 cfu·mL-1大腸埃希菌菌液1mL，35℃培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)物0.2mL，接種至含MUG培養(yǎng)基5mL的試管中，35℃培養(yǎng)，5，24 h在366 nm紫外光燈下觀察，管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)藍白熒光，為MUG陽性;然后進行靛基質(zhì)實驗，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性。

2.4.2 陰性菌對照組 方法同實驗組，實驗菌為金黃色葡萄球菌菌液。結(jié)果管內(nèi)培養(yǎng)物不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性;然后進行靛基質(zhì)實驗，液面呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。

表1 常規(guī)法回收率測定結(jié)果

表2 培養(yǎng)基稀釋法回收率測定結(jié)果

2.4.3 供試品對照組 方法同實驗組，但不加實驗菌，結(jié)果同陰性菌對照組。

2.4.4 結(jié)果判斷 實驗組檢出實驗菌，陰性菌對照組未檢出實驗菌，結(jié)果符合要求，控制菌按常規(guī)法檢查即可。

3 討論

消癌平片的微生物限度檢查驗證實驗中，稀釋劑對照組各菌落計數(shù)回收率均＞70%;常規(guī)法菌落計數(shù)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率＜70%;培養(yǎng)基稀釋法各菌落計數(shù)回收率均＞70%，按供試品制備方法和培養(yǎng)基稀釋法對消癌平片進行細菌檢查，真菌和酵母菌檢查、控制菌檢查采用常規(guī)法是固定可行的。

實驗制備計數(shù)用的菌液稀釋到合適的濃度后，菌落數(shù)在48 h后有較大變化，宜控制好實驗時間，實驗的同時進行活菌計數(shù)，才能保證實驗結(jié)果的準確性。

目前國家越來越重視微生物限度檢查，《中華人民共和國藥典》收載的品種也越來越多?！吨腥A人民共和國藥典》從2005年版開始對微生物限度檢查要求進行方法學的驗證實驗。由于某些供試品具有抗菌或抑菌活性，其本身會影響檢驗結(jié)果的準確性。通過方法學驗證，避免了采用常規(guī)方法難以檢出菌落，而得出“陰性”或計數(shù)偏低的“合格”結(jié)論的情況。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄C 79－88.

［2］中國藥品生物制品檢定所，中國藥品檢驗總所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:351－407.

［3］顏棟林，李萍，蘭茜.冠心丹參片微生物限度檢查法方法驗證［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，29(8):1080－1081.

［4］張麗梅，李俊，邢建華.抗生丸微生物限度檢查法的驗證［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，28(6):792－793.

［5］李俊，張麗梅.6種中成藥微生物限度檢查方法驗證［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，29(9):1222－1223.

［6］馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊［M］.北京:科學出版社，2000:65.