張秀花

山東省菏澤市藥品檢驗所，山東菏澤 274000

丹紅注射液是由丹參和紅花兩種中藥材經(jīng)化學提取精制而成的注射液，具有活血化瘀，通脈舒絡(luò)之功效，用于瘀血閉阻所致的胸痹、中風、胸痛、胸悶、心悸、口眼歪斜、言語蹇澀、肢體麻木、活動不利等癥，并用于冠心病、心絞痛、心肌梗塞、瘀血型肺心病、缺血性腦病、腦血栓等。由于療效顯著，臨床應(yīng)用日趨廣泛[1]，為國家重點保護的中藥品種。作為重點檢驗項目之一的安全性評價，目前仍采用家兔法檢查熱原[2]。細菌內(nèi)毒素檢查具有快速、靈敏、操作簡便、重現(xiàn)性好的特點。為此，特采用此法取代家兔熱原檢查法檢測丹紅注射液中細菌內(nèi)毒素，旨在為丹紅注射液的應(yīng)用提供更為科學的檢測方法。

1 儀器與試藥

鱟試劑（湛江博康海洋生物有限公司，批號：1007020，靈敏度0.125 EU/ml；福州新北生化工業(yè)有限公司，批號：10111912，靈敏度0.125 EU/ml），細菌內(nèi)毒素檢查用水（湛江博康海洋生物有限公司，批號：1005050，內(nèi)毒素含量≤0.015 EU/ml），細菌內(nèi)毒素工作標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：150601-201072，每支 120 EU），丹紅注射液（菏澤步長制藥有限公司，批號：110164、110174、110172），旋渦混合器（常州國華電器有限公司），TAL-40D型試管恒溫儀（湛江安度斯生物有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹紅注射液中細菌內(nèi)毒素限值（L）確定

根據(jù)公式L=K/M，其中，K為每公斤體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑K=5.0 EU/（kg·h），M為人用每公斤體重每小時的最大供試品劑量。丹紅注射液臨床最大用量成人為60 ml[2]，按成人體重60 kg計算，代入公式計算丹紅注射液的細菌內(nèi)毒素限值，L=K/M=5.0／（60/60）=5.0 EU/ml。

2.2 供試品的最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）

市售鱟試劑的靈敏度（λ）在0.5～0.03 EU/ml之間，根據(jù)《中國藥典》2010年版二部附錄 “細菌內(nèi)毒素指導原則”，丹紅注射液的有效稀釋倍數(shù)為10～167倍，本試驗采用靈敏度為 0.125 EU/ml的鱟試劑，MVD=L/λ=1×（5.0/0.125）=40倍。

2.3 鱟試劑靈敏度的復核

按細菌內(nèi)毒素檢查法[3]，將細菌內(nèi)毒素工作標準品（WSE）用細菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水）溶解，在旋渦混合器上混合15 min，然后制成 2 λ、1 λ、0.5 λ、0.25 λ 系列濃度的內(nèi)毒素工作標準品溶液，每稀釋一步，均在旋渦混合器上混合30 s，每一濃度平行做4管，同時做2管陰性對照。將試管振搖混合均勻后，置于（37±1）℃試管恒溫儀中 60 min，結(jié)果兩批鱟試劑的靈敏度均在0.5 λ～2.0 λ范圍內(nèi)，可用于供試品的干擾試驗。見表1。

表1 鱟試劑靈敏度的復核試驗結(jié)果

2.4 供試品的干擾初篩試驗[4]

用BET水將丹紅注射液分別稀釋成 40、20、10、5倍的系列濃度，以各稀釋倍數(shù)的樣品將 WSE 制成 2 λ、1 λ、0.5 λ、0.25 λ系列濃度的供試品內(nèi)毒素溶液，與鱟試劑混合進行抑制試驗。結(jié)果顯示，供試品原液對鱟試劑有抑制作用，當稀釋至5倍時無干擾作用，3份樣品結(jié)果均相同。見表2。

表2 供試品的干擾初篩結(jié)果

2.5 供試品的干擾試驗

根據(jù)干擾初篩試驗結(jié)果[5]，最小不干擾濃度為5倍樣品稀釋液。為確保檢測結(jié)果準確可靠，本試驗采用10倍樣品稀釋液進行正式干擾試驗。用丹紅注射液（BET水10倍稀釋液）將 WSE 稀釋制成 2 λ、1 λ、0.5 λ、0.25 λ 系列濃度的供試品內(nèi)毒素溶液，每一濃度平行做4管，另取BET水和10倍樣品稀釋液各做兩管陰性對照液，依法操作[6]。結(jié)果表明，Es均在 0.5 λ～2.0 λ 范圍內(nèi)，且 Et也均在 0.5 Es～2.0 Es 范圍內(nèi)。說明樣品稀釋10倍后，對鱟試劑無干擾作用。見表3。

表3 供試品干擾試驗結(jié)果

2.6 供試品溶液的細菌內(nèi)毒素檢測[7]

根據(jù)干擾試驗的結(jié)果和擬定的細菌內(nèi)毒素濃度，取樣品3批，分別用BET水稀釋10倍后，采用兩個廠家的鱟試劑進行檢測，結(jié)果均符合規(guī)定。見表4。

表4 樣品稀釋溶液的細菌內(nèi)毒素檢測結(jié)果

3 討論

參考有關(guān)文獻[8-9]，采用兩個廠家的鱟試劑對3個批次的樣品進行干擾試驗，從初篩試驗可以看出，丹紅注射液對鱟試劑有干擾作用，當樣品稀釋至5倍時，可以排除干擾，確定最小不干擾濃度為5倍樣品稀釋液。為確保試驗結(jié)果的準確可靠，提高檢測靈敏度，建議實際操作時將樣品稀釋10倍或采用更高靈敏度的鱟試劑。此試驗說明，細菌內(nèi)毒素檢查法可以代替家兔法用于熱原檢查。

[1]胡燕,趙亞清,肖峰,等.丹紅注射液治療急性腦梗死隨機對照試驗的Meta分析[J].中國醫(yī)院藥學雜志,2009,29(20):1795.

[2]國家藥品監(jiān)督管理局.國家中成藥標準匯編[S].內(nèi)科心系分冊,2002:278.

[3]國家藥典委員會.中國藥典[S].二部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄99.

[4]鄭霞,趙毓梅,劉春.葛根素注射液細菌內(nèi)毒素檢查[J].中國藥房,18(16):1254.

[5]夏振民.藥品細菌內(nèi)毒素檢查的限值[J].藥物分析雜志,1995,15(3):54-55.

[6]陳燕華,徐晉輝.脈絡(luò)寧注射液中細菌內(nèi)毒素的檢查[J].華西藥學雜志,2005,20(1):69-70.

[7]張偉,周繼春.硫酸羅通定注射液細菌內(nèi)毒素檢查法的研究[J].2009,10(6):429-432.

[8]中國生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:310-320.

[9]梁陳方,李錦燊.凝膠法測定新魚腥草素鈉注射液細菌內(nèi)毒素[J].廣西醫(yī)學,2006,28(11):1775-1776.