王 勛，羅珊珊，蔣嘉燁，陸家鳳，可 燕

(上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心，上海 201203)

鳥苷(guanosine)屬嘌呤核苷一類成分，廣泛存在于半夏、板藍根、黃芪、當(dāng)歸等藥用植物之中。核苷類成分作為抗病毒和抗代謝藥物已被廣泛報道和應(yīng)用［1－2］，但尚未見對其中鳥苷的研究報道。因此，為探索鳥苷的藥理作用，本實驗在大鼠離體胸主動脈環(huán)灌流模型的基礎(chǔ)上通過觀察鳥苷對去除內(nèi)皮血管環(huán)的張力的影響，探討其對大鼠血管環(huán)的作用及可能的機制。

1 材料與方法:

1.1 設(shè)備 Powerlab八通道多功能生理記錄儀(AD Instruments公司)，Powerlab血管功能測定系統(tǒng)(AD Instruments公司)。

1.2 藥物與試劑 乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)、去氧腎上腺素(phenylephrine，PE)、毛喉素(forskolin，F(xiàn)SK)、葡萄糖(glucose)購于 Sigma公司，左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)、亞甲藍(methylene blue)、吲哚美辛(indomethacin)購于Adamas公司，鳥苷購于上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化中心。KCl等無機試劑均為國產(chǎn)分析純。Krebs-Henseleit(K-H)工作液(mmol·L－1:NaCl 118，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgCl21.2，NaHCO325，CaCl22.5，Glucose 11，pH=7.4)。

1.3 實驗動物 SD大鼠，♂，體質(zhì)量(250±10)g，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。

1.4 血管環(huán)制備 迅速游離SD大鼠胸主動脈，置于4℃，含95%O2和5%CO2混合氣體預(yù)飽和的K-H液中，剔除周圍結(jié)締組織，剪成3～4 mm的血管環(huán)。將血管環(huán)懸掛于預(yù)置5 ml K-H液的浴槽內(nèi)，37℃恒溫，持續(xù)通入95%O2和5%CO2的混合氣體。胸主動脈每條血管給予2.0 g拉力，每20 min換液1次，平衡60 min。以60 mmol·L－1的 KCl預(yù)收縮兩次，以誘發(fā)血管的最大收縮幅度，待血管穩(wěn)定后，加入1 μmol·L－1濃度的 PE 收縮，待血管拉力達到坪值后，加入梯度濃度的 ACh(10－9、10－8、10－7、10－6、10－5mol·L－1)，觀察血管的舒張情況來檢驗內(nèi)皮完整性。觀察去內(nèi)皮血管環(huán)時，引起的舒張反應(yīng)小于20%則認(rèn)為內(nèi)皮失去功能。

1.5 大鼠胸主動脈舒張功能測定 檢驗內(nèi)皮完整性后，血管環(huán)用K-H液清洗3次，至其恢復(fù)基礎(chǔ)張力。然后以PE 1 μmol·L－1誘發(fā)最大收縮幅度，加入藥物后觀察藥物的舒張情況，以FSK 1 μmol·L－1舒張程度作為 100%的舒張［3］。

1.6 累積濃度的鳥苷對基礎(chǔ)狀態(tài)或KCl預(yù)收縮血管環(huán)的影響 以不同累積濃度的鳥苷直接作用于基礎(chǔ)狀態(tài)血管環(huán)或KCl(60 mmol·L－1)預(yù)收縮血管環(huán)，實驗組(n=6)采用累積加藥法，每2min加鳥苷1 次，使灌流液中鳥苷終濃度分別達 10－9，10－8，10－7，10－6，10－5mol·L－1，觀察鳥苷對血管環(huán)的作用，對照組(n=6)以K-H液代替鳥苷累積加入。

1.7 累積濃度的鳥苷對PE預(yù)收縮的血管環(huán)的影響 以不同累積濃度的鳥苷作用于PE預(yù)收縮的血管環(huán)，實驗組(n=6)以 10－4mol·L－1預(yù)收縮，采用累積加藥法，具體方法如“1.6”所述，觀察鳥苷作用;對照組(n=6)以K-H液替代鳥苷累積加入。

1.8 鳥苷對用L-NAME、亞甲藍和吲哚美辛預(yù)處理的內(nèi)皮完整的血管環(huán)PE誘導(dǎo)的收縮影響 分別以L-NAME、吲哚美辛和亞甲藍(0.1 mmol·L－1)孵育內(nèi)皮完整血管環(huán)20 min后，以PE預(yù)收縮，觀察累積濃度鳥苷的血管舒張作用;對照組(n=6)以K-H液替代鳥苷累積加入。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗結(jié)果用SPSS 11.0軟件分析，以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 累積濃度的鳥苷對基礎(chǔ)狀態(tài)和KCl預(yù)收縮血管環(huán)的作用 在基礎(chǔ)狀態(tài)下和KCl預(yù)收縮狀態(tài)下，各累積濃度鳥苷對具內(nèi)皮和去內(nèi)皮血管環(huán)均無明顯作用(P＞0.05)。見Fig 1。

Fig 1 Effect of guanosine on vasomotor function of intact endothelium or endothelium-denuded aortic rings in basal tension(A)and precontracted by KCl(B).

2.2 累積濃度的鳥苷對PE預(yù)收縮的血管環(huán)的作用 內(nèi)皮完整組中，給藥組與對照組相比，差異具有顯著性(P＜0.05)，給藥組具有30%以上的舒張率，說明鳥苷可舒張PE預(yù)收縮的大鼠血管環(huán)。去內(nèi)皮組中，各濃度的鳥苷不能使PE收縮的血管舒張，結(jié)果與對照組相比，差異無顯著性(P＞0.05)。

2.3 鳥苷對用L-NAME、亞甲藍和吲哚美辛預(yù)處理的內(nèi)皮完整的血管環(huán)PE誘導(dǎo)的收縮作用 吲哚美辛組中，對照組與給藥組相比差異無顯著性，而L-NAME組與亞甲藍組中，對照組與給藥組相比差異有顯著性。說明一氧化氮合酶抑制劑L-NAME或鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑亞甲藍預(yù)處理，對于鳥苷的血管舒張作用有明顯的抑制作用。

Fig 2 Effect of guanosine on vasomotor function of intact endothelium or endothelium-denuded aortic rings precontracted by phenylephrine PE(A)and after incubated with indomethacin or L-name or Methylene Blue(B)

3 討論

鳥苷廣泛存在于藥用植物中，并且作為藥物質(zhì)量控制的指標(biāo)成分被廣泛應(yīng)用［4－5］。本實驗在觀察鳥苷對大鼠離體胸主動脈血管環(huán)(內(nèi)皮完整)的作用時發(fā)現(xiàn)，其對基礎(chǔ)狀態(tài)的血管環(huán)張力無影響，對KCl預(yù)收縮的血管環(huán)張力也無明顯作用，對PE預(yù)收縮的血管環(huán)具有舒張作用。

關(guān)于 PE和 KCl的舒張機制，已有研究表明［6－9］，雖然兩者都可通過增加細胞內(nèi)鈣離子的濃度而引起血管收縮，但機制卻不同。KCl引起平滑肌細胞超極化而刺激血管收縮，其機制主要是開放細胞膜上的電壓門控型鈣通道，引起細胞外鈣內(nèi)流。而PE誘導(dǎo)的血管收縮是激活α1-腎上腺素受體的結(jié)果，主要是通過激活磷脂酶C，產(chǎn)生二酞甘油(diacylslyeerol，DAG)和三磷酸肌醇(1，4，5-triphosphateinositol，IP3)，DAG可以通過蛋白激酶 C(protein kinase，PKC)激活肌凝蛋白輕鏈，而IP3則可以誘導(dǎo)肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣離子釋放。本實驗中鳥苷不能舒張KCl誘導(dǎo)的血管收縮，說明鳥苷的舒縮機制可能與電壓門控鈣通道無關(guān)，而可能與抑制血管平滑肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲鈣釋放有關(guān)。血管環(huán)的舒張不僅可由阻斷Ca通道引發(fā)，亦可通過血管內(nèi)皮的血管舒張因子引發(fā)。

進一步研究表明，一氧化氮合酶抑制劑 LNAME或鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑亞甲藍可明顯抑制鳥苷的舒張作用。內(nèi)皮依賴性的血管舒張主要是通過刺激內(nèi)皮細胞產(chǎn)生 NO［10－11］，NO 為血管內(nèi)皮細胞合成的強效血管舒張因子，NO在內(nèi)皮NOS的作用下由左旋精氨酸轉(zhuǎn)化而來，通過激活平滑肌細胞可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，增加環(huán)鳥苷酸含量而使血管平滑肌舒張［12］，因此推測NO-GC-cGMP途徑可能介導(dǎo)了鳥苷的內(nèi)皮依賴性舒血管。吲哚美辛是環(huán)氧化酶的非特異性抑制劑，而花生四烯酸在環(huán)氧化酶的作用下可形成前列環(huán)素等血管舒張因子［13］，以吲哚美辛孵育對內(nèi)皮依賴性的血管環(huán)無影響，說明其舒縮機制可能與前列環(huán)素的合成與釋放無關(guān)。

綜上，鳥苷對大鼠離體血管胸主動脈的舒張作用可能是多種途徑共同作用的結(jié)果，一方面其內(nèi)皮依賴性舒張機制可能與NO-GC-cGMP途徑相關(guān)，同時可能與IP3誘導(dǎo)的內(nèi)鈣釋放相關(guān)，確切機制尚有待于我們進一步研究。

［1］ 冷玲穎，蔡志強，孫鐵民.核苷類抗病毒前藥的研究進展［J］.中國藥物化學(xué)雜志，2008，18(4):310 －6.

［1］ Leng L Y，Cai Z Q，Sun T M.Strategy in the study of nucleoside antiviral prodrugs［J］.Chin J Med Chem，2008，18(4):310 －6.

［2］ 張 浩，孫宏斌.核苷類抗代謝藥物的研究進展［J］.中國新藥與臨床雜志，2010，29(11):806 －12.

［2］ Zhang H，Sun H B.Recent research and development of nucleoside analogues as antimetabolite agents［J］.Chin J New Drug Clin Remed，2010，29(11):806 －12.

［3］ 王現(xiàn)珍，蔣嘉燁，陸家鳳，等.SHR高血壓進程中不同類型血管內(nèi)皮功能損傷及藥物修復(fù)研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2010，26(2):163－8.

［3］ Wang X Z，Jiang J Y，Lu J F，et al.Study in the damage of endothelial function and administration recovery among different arteries during the developing progress of SHR［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(2):163 －8.

［4］ 呂愛娟，張志澄，張科衛(wèi).RP-HPLC法測定半夏中5種核苷含量的研究［J］.藥物分析雜志，2007，27(7):1051－4.

［4］ Lü A J，Zhang Z C，Zhang K W，et al.RP-HPLC determination of five nucleosides in Rhizoma Pinellie［J］.Chin J Pharm Analys，2007，27(7):1051 －4.

［5］ 張元杰，錢正明，陳肖家.HPLC法同時測定補益中藥中尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷的含量［J］.藥物分析雜志，2010，30(1):33－6.

［5］ Zhang Y J，Qian Z M，Chen X J，et al.Simultaneous HPLC determination of uridine，adenine，guanosine，and adenosine in six tonic traditional Chinese medicines［J］.Chin J Pharm Analys，2010，30(1):33－6.

［6］ Zhang B Q，Hu S J，Qiu L H，et al.Diphasie effets of astragalus membranaceus(Leguminosae)on vaseular tone in rat thoracie aorta［J］.Biol Pharm Bull，2005，28(8):1450 － 4.

［7］ Putney J W.Receptor-regulated calcium entry［J］.Pharmacol T-her，1990，48(3):427 －34.

［8］ Rembold C M.Regulation of contraction and relaxation in arterial smooth muscle［J］.Hypertension，1992，20(2):129 －37.

［9］ 張博男，儲金秀，韓淑英.蕎麥花葉總黃酮的舒張血管作用及其機制［J］.中國藥理學(xué)通報，2010，26(7):952－6.

［9］ Zhang B N，Chu J X，Han S Y.Relaxant effects of total flavonoids of buckwheat flowers and leaves on rat thoracic aorta and underlying mechanisms［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(7):952 － 6.

［10］ Qi Y M，Yang D J，Duan X，et al.Endomorphins inhibit contractile responses of rat thoracic aorta rings induced by phenylephrine and angiotensinⅡ in vitro［J］.Acta Pharmacol Sin，2002，23(1):40－1.

［11］ Gioaid A，Saleh D.Reduced expression of endothelia nitric oxide synthase in the lungs of patients with pulmonary hypertension［J］.N Engl J Med，1995，333(7):214－21.

［12］ Tanaka Y，Koyke K，Toro L.MaxiK channel roles in blood vessel relaxations induced by endothelium-derived relaxing factors and their molecular mechanisms［J］.J Smooth Muscle Res，2004，40(4-5):125－53.

［13］王旭慧，朱 亮，陳 紅.黃芪甲苷對正常大鼠離體血管功能的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2006，22(11):1319－24.

［13］Wang X H，Zhu L，Chen H.Effect of astragalosideⅣ on contraction and relaxation in isolated rat aortic rings［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(11):1319 －24.