王世博，邱景富，白群華，李佳佳，和晉渝，高艷軍，于 超

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，重慶 400016;2.重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院重慶 400016，3.重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院，重慶 400016)

隨著全球人口的老齡化，帕金森病(Parkinson's disease，PD)、阿爾采末病(Alzheimer's disease，AD)等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率也逐漸增加，給家庭與社會帶來沉重的負擔(dān)。目前，PD、AD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制仍不是十分清楚。近年來的大量研究表明，線粒體功能損傷［1］、細胞凋亡［2］、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［3－4］、氧化應(yīng)激以及氧自由基［5］損傷廣泛參與了其致病過程，其中氧化應(yīng)激對于神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展起到非常重要的作用。因此，從天然產(chǎn)物中探索或發(fā)現(xiàn)抗氧化作用的化合物并闡明作用機制，對預(yù)防此類疾病的發(fā)生具有重要的現(xiàn)實意義。

傳統(tǒng)中藥黃芪具有抗氧化、清除自由基、抗炎等多種生物活性作用［6］，黃芪甲苷(AstragalosideⅣ，ASⅣ)為黃芪皂苷類單體成分，被認為是黃芪的主要活性成分。有報道表明，黃芪甲苷可有效延緩機體細胞的衰老過程，促進原代培養(yǎng)神經(jīng)元增殖，抑制炎癥(如 LPS)對單核細胞的損傷［7－8］等作用，但黃芪甲苷是否能有效抑制氧化應(yīng)激所致的神經(jīng)元損傷，尚未見報道。本研究通過建立PC12細胞氧化應(yīng)激體外模型，探討黃芪甲苷對PC12細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用與機制，為有效防治神經(jīng)退行性疾病提供有益的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12細胞由中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所提供;DMEM-F12培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Gibco公司。黃芪甲苷購于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司(黃芪甲苷的溶媒為DMSO，儲存液濃度為10 mmol·L－1，應(yīng)用液濃度為 10 nmol·L－1及 100 nmol·L－1。)。H2O2購于重慶川東化工有限公司。Hoechst 33258染色液購于碧云天生物技術(shù)研究所。MTT(噻唑藍)試劑、Vit C、JC-1染料購于美國Sigma公司。蛋白裂解液以及β-actin抗體購于CST(Cell Signaling Technology)公司。ECL發(fā)光劑購于Millipore公司。Cyclin D1抗體、Cyclin A抗體、Phosphop38抗體、T-p38 MAPK抗體購于美國Santa Cruz公司。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞培養(yǎng) PC12細胞按常規(guī)培養(yǎng)，DMEMF12培養(yǎng)基，10%Gibco胎牛血清，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.125% 胰酶消化傳代，選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 實驗分組及藥物處理 實驗分組為:正常對照組、H2O2(300 μmol·L－1)模型組、黃芪甲苷(10 nmol·L－1)+H2O2(300 μmol·L－1)低濃度處理組、黃芪甲苷(100 nmol·L－1)+H2O2(300 μmol·L－1)高濃度處理組及陽性對照 Vit C(200 mg·L－1)+H2O2(300 μmol·L－1)。孵育24 h 后，除正常對照組外，其余各組吸棄原培養(yǎng)液，加入含相同濃度藥物和相應(yīng)濃度的H2O2培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育4 h后，檢測各項實驗指標。

1.4 MTT法檢測PC12細胞活力 選取對數(shù)生長期PC12細胞，接種于96孔板內(nèi)，每孔加培養(yǎng)液200 μl，接種量8 000個/孔，待細胞長至孔底80%時進行實驗。實驗分組及藥物處理同“1.3”。細胞活力/%=處理組OD值 /空白對照組OD值×100%。

1.5 Hoechst 33258熒光核染色 將PC12細胞接種于12孔板內(nèi)，實驗分組及藥物處理同“1.3”。12孔板內(nèi)加入PBS洗3次，用4% 多聚甲醛室溫下固定細胞30 min，PBS洗3次，每孔加入300 μl Hoechst 33258染色液，室溫下避光染色5 min，PBS洗3次，在熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率、胞內(nèi)ROS、細胞周期 實驗分組及藥物處理同“1.3”，胰酶消化收集各組細胞后，PBS洗3次，分別加入 AnnexinVFITC和PI染液，室溫下避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

實驗分組及藥物處理同“1.3”，PBS洗3次，加入ROS熒光探針DCFH-DA置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，收集各組細胞后，PBS洗3次，流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。

實驗分組及藥物處理同“1.3”，收集細胞后，PBS洗3次，加入70% 冰乙醇固定24 h以上，加入PI染液，37℃ 避光孵育20 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.7 Western blot分析 實驗分組及藥物處理同“1.3”，收集細胞后，加入 150 μl蛋白裂解液(含10%PMSF、10%Tyr抑制劑、10%Ser/Thr抑制劑)，冰上反復(fù)吹打，置低溫離心機于4℃、12 000×g離心15 min，取上清液加入5×的上樣緩沖液，煮沸10 min，電泳并轉(zhuǎn)PVDF膜。5% 脫脂奶粉封閉1 h后，分別使用 Cyclin D1、Cyclin A、Phosphop38、T-p38以及 β-actin單克隆抗體，4℃ 孵育過夜，PBST洗3次，二抗室溫下孵育1 h，PBS洗3次，ECL化學(xué)發(fā)光法進行顯影。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 本文中的各項實驗每組均重復(fù)3次以上，采用SPSS 12.0軟件進行 統(tǒng)計學(xué)處理 ，數(shù)據(jù)用±s表示，兩組間比較采用t檢驗分析，多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析法處理。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對H2O2作用PC12細胞活力的影響

為了確立PC12細胞損傷模型中合適的H2O2濃度，首先分析不同濃度的H2O2、不同作用時間下PC12細胞活力的變化。結(jié)果顯示:細胞活力與H2O2濃度及其作用的時間呈正相關(guān)，即與正常對照組相比，各實驗組細胞活力隨H2O2濃度增大而下降，隨H2O2作用時間延長而下降。其中300 μmol·L－1H2O2組，當(dāng)作用時間為4h時細胞活力下降約為65% ，選取300 μmol·L－1H2O2濃度制作應(yīng)激損傷模型(Fig 1)。

經(jīng)篩選確定采用 10 nmol·L－1與 100 nmol·L－1濃度的黃芪甲苷，與PC12細胞孵育24 h。結(jié)果顯示:此濃度范圍的黃芪甲苷對PC12細胞的活力均不會產(chǎn)生影響(Fig 2)。但不同濃度黃芪甲苷預(yù)保護24 h后經(jīng)H2O2處理4 h，其對PC12細胞活力有明顯作用。與H2O2模型組相比，100 nmol·L－1黃芪甲苷細胞活力明顯提高(P＜0.01)，與陽性對照組Vit C效果相當(dāng)，見Fig 3。表明黃芪甲苷對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞的氧化應(yīng)激損傷具有保護作用。

Fig 1 Viability losses in PC12 cells induced by H2O2under different concentrations and time

Fig 2 Viability change of PC12 cells treated by ASⅣunder different concentration circumstances after 24 h.

Fig 3 ASⅣinhibited H2O2-induced injury in PC12 cells

2.2 黃芪甲苷對H2O2作用PC12細胞內(nèi)核酸的保護作用 H2O2對細胞核內(nèi)的核酸有明顯的損傷，為了驗證黃芪甲苷對此類損傷是否具有保護作用，對上述實驗分組，采用熒光染色法進行測定?？瞻讓φ战M細胞核染色有均勻的低強度熒光，胞核較大(Fig 4A);H2O2模型組細胞核出現(xiàn)高強度集中的熒光，且胞核變小、濃集，呈現(xiàn)出凋亡細胞的特征(Fig 4B);加入黃芪甲苷預(yù)處理后，細胞核熒光強度隨劑量增加而降低，胞核逐漸恢復(fù)正常形態(tài)(Fig 4C、D)。表明黃芪甲苷對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞核內(nèi)核酸的損傷具有保護作用。

2.3 黃芪甲苷對H2O2作用PC12細胞凋亡率的影響 既然黃芪甲苷對胞內(nèi)核酸損傷有保護作用，借此，應(yīng)觀察其對細胞凋亡的影響。由流式細胞儀檢測結(jié)果可知，H2O2模型組PC12細胞凋亡率為26.41% ，而黃芪甲苷不同濃度處理的細胞凋亡率分別恢復(fù)到9.71%(10 nmol·L－1)和 9.04%(100 nmol·L－1)，見Fig 5。提示黃芪甲苷的確具有抗氧化應(yīng)激損傷所致細胞凋亡的能力。

2.4 黃芪甲苷對 H2O2作用 PC12細胞后胞內(nèi)ROS產(chǎn)生及細胞周期的影響 為了探討黃芪甲苷對氧化損傷的保護機制，采用流式細胞儀檢測了其對細胞周期和胞內(nèi)ROS的影響。結(jié)果與對照組比較，H2O2模型組ROS產(chǎn)量高達320% ，不同濃度(10 nmol·L－1和 100 nmol·L－1)黃芪甲苷組 ROS產(chǎn)量分別為292% 與170% ，與模型組相比藥物組對ROS的降低明顯(P＜0.01)(Fig 6)。提示黃芪甲苷可能通過降低胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生起到保護細胞的作用。

從細胞周期分析可以發(fā)現(xiàn):與對照組(G1期:50.24%;S期:43.93%)相比，H2O2模型組G1期細胞下降為41.97%(P＜0.01)，S期細胞上升為53.23%(P＜0.01)。與H2O2模型組相比，不同濃度黃芪甲苷預(yù)處理細胞后，G1期細胞分別恢復(fù)到46.72%(10 nmol·L－1組)和 50.39%(100 nmol·L－1組)，均高于模型組(P＜0.01);而S期細胞分別恢復(fù)到52.12%與49.02%，100 nmol·L－1黃芪甲苷組S期低于H2O2模型組(P＜0.01)，見Fig 7。結(jié)果提示:H2O2模型組細胞周期被阻滯在S期，加入高濃度黃芪甲苷后可以緩解此現(xiàn)象。

、2.5 黃芪甲苷能恢復(fù)H2O2對細胞周期蛋白Cyclin D1、A表達的影響 由于細胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin A參與調(diào)控細胞周期，黃芪甲苷是否通過調(diào)控Cyclin D1及Cyclin A的表達抑制細胞凋亡的發(fā)生?為了驗證這一假設(shè)，通過Western blot分析顯示，與對照組相比，H2O2模型組CyclinD1表達降低，而不同濃度黃芪甲苷預(yù)保護組及陽性對照組與模型組相比，均可以恢復(fù)Cyclin D1的表達(P＜0.01)(Fig 8A)，而對Cyclin A的表達則無影響(Fig 8B)。表明，黃芪甲苷對細胞周期的調(diào)控機制之一可能是通過上調(diào)由H2O2所致Cyclin D1表達的下降而發(fā)揮調(diào)控作用。

Fig 4 ASⅣinhibited H2O2-induced oxidative damage in PC12 cells by Hoechst 33258 stain

Fig 5 ASⅣprotected PC12 cells from injury induced by H2O2

2.6 黃芪甲苷抑制H2O2誘發(fā)的p38/MAPK信號通路的激活 為了進一步探討黃芪甲苷是否通過抑制H2O2誘發(fā)的PC12細胞p38/MAPK信號通路的激活，從而對PC12細胞起到保護作用。通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，H2O2模型組磷酸化p38表達升高(Fig 9);而不同濃度黃芪甲苷預(yù)保護組與模型組相比，均能夠明顯降低磷酸化p38的表達(P＜0.01)。表明黃芪甲苷保護細胞氧化損傷的分子機制之一是:可以抑制H2O2誘發(fā)的PC12細胞p38/MAPK信號通路的激活。

3 討論

神經(jīng)元進行性丟失是神經(jīng)退行性疾病的一個主要病理特征，其中氧化應(yīng)激在神經(jīng)元凋亡過程中起主要作用［9］。神經(jīng)元含有較豐富的對自由基敏感的多不飽和脂肪酸，易遭受自由基攻擊;且神經(jīng)元內(nèi)具有抗氧化活性的谷胱甘肽含量較低，使其清除自由基能力下降，以上因素進一步促進了神經(jīng)元對氧化應(yīng)激損傷的敏感性［10］。如何有效降低氧化應(yīng)激對神經(jīng)元的損傷已成為近年來治療神經(jīng)退行性疾病的一個研究熱點。本實驗通過MTT法和流式細胞術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能夠提高H2O2損傷所致PC12細胞的細胞活力的降低，降低胞內(nèi)由H2O2誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)量及細胞凋亡率。

Fig 6 The fluorescence value decreased after treating with ASⅣin PC12 cells induced by H2O2

Fig 7 Cell cycle assessment of PC12 cells by flow cytometry

Fig 8 Effects of AS Ⅳ on Cyclin D1(A)and Cyclin A(B)expressions of PC12 cells induced by H2O2.

近年來的研究表明，細胞凋亡與細胞增殖周期密切相關(guān)［11］，阻斷細胞增殖周期進程可以引起凋亡，并且凋亡也常伴隨細胞周期阻滯。Cyclin D1及Cyclin A是反應(yīng)細胞周期變化的蛋白，參與調(diào)控細胞周期G1期到S期的轉(zhuǎn)變，可以加速細胞周期的進程［12－13］。本實驗通過流式檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能夠緩解H2O2對PC12細胞G0/G1期至S期的阻滯現(xiàn)象。為了進一步了解黃芪甲苷緩解細胞周期阻滯的機制，通過Western blot檢測各實驗組Cyclin D1及Cyclin A的蛋白表達水平發(fā)現(xiàn)，與模型組比較黃芪甲苷能夠上調(diào)細胞周期蛋白Cyclin D1的表達，而對Cyclin A的表達無影響。實驗結(jié)果提示:黃芪甲苷可能通過調(diào)控周期蛋白Cyclin D1的表達，從而影響細胞恢復(fù)正常增殖規(guī)律。

Fig 9 Effects of ASⅣon p38MAPK phosphorylation of PC12 cells induced by H2O2

p38/MAPK信號通路途徑廣泛參與了環(huán)境應(yīng)激的應(yīng)答、炎癥的調(diào)控及細胞的凋亡。越來越多的研究顯示［14－15］，p38/MAPK 信號通路途徑也參與了細胞增殖的正性與負性調(diào)節(jié)。黃芪甲苷可能通過調(diào)節(jié)p38/MAPK信號通路對細胞增殖發(fā)揮作用。本實驗為了進一步驗證此假設(shè)，通過 Western blot檢測p38/MAPK蛋白的磷酸化表達水平，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能夠抑制p38/MAPK信號通路的激活。有研究報道［16－17］，某些含有絲氨酸或蘇氨酸磷酸化位點的磷酸激酶通常也含有O-連接的糖基化(O-GlcNAc)位點。因此，磷酸化與糖基化的相互競爭可以對相應(yīng)的激酶產(chǎn)生雙向調(diào)節(jié)作用，最終影響其在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。本實驗中黃芪甲苷是否通過調(diào)節(jié)OGT水平發(fā)揮作用還有待進一步的驗證。

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