秦 攏 ，張永鋒，姬雪禮，李向軍 ，李 寧

(1.石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，河北 石家莊 050035; 2.華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司，河北 石家莊 050015)

利水消腫膠囊是石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司自主研發(fā)的中藥六類新藥，由當歸、柴胡、茯苓、澤瀉等11味中藥組方，具有疏肝健脾、通絡利水功效，用于治療特發(fā)性水腫。筆者進行了定性定量研究，建立了桂枝、柴胡、白芍、益母草、澤瀉的薄層色譜鑒別方法及阿魏酸高效液相色譜定量方法，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

定量毛細管(美國Drummond);KQ－250型超聲波清洗器;Agilent 1100型series高效液相色譜儀。利水消腫膠囊(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號分別為090901，090902，090903);阿魏酸對照品(批號為110773－200611)，桂皮醛對照品(批號為110710－200714)，芍藥苷對照品(批號為110736－200833)，鹽酸水蘇堿對照品(批號為11012－200709)，柴胡對照藥材(批號為120992－200705)，澤瀉對照藥材(批號為121081－200603)均由中國藥品生物制品檢定所提供;硅膠G(青島海洋化工廠);雙蒸餾水(自制)，乙腈(Fisher)為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

桂枝:取本品10粒的內(nèi)容物，加石油醚(60～90℃)10 mL，振搖5 min，靜置，取上清液作為供試品溶液。按處方比例取缺桂枝的藥材，依照制備工藝制得桂枝空白樣品，按供試品溶液制備法操作，即得陰性對照品溶液。另取桂皮醛對照品，加乙醇制成每1 mL含1 μL的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典》(一部)附錄ⅥB]試驗，吸取供試品溶液及陰性對照品溶液各5～10μL、對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯－乙酸乙酯－冰醋酸(92∶5∶5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼乙醇試液。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照品溶液對鑒別無干擾(圖1 A)。

柴胡:取本品10粒的內(nèi)容物，研細，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣用三氯甲烷洗滌3次，每次20 mL，棄去三氯甲烷液;再用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。按處方比例取缺柴胡的藥材，依照制備工藝制得柴胡空白樣品，按供試品溶液制備法操作，即得陰性對照品溶液。另取柴胡對照藥材1 g，加甲醇10 mL，超聲處理20 min，靜置，取上清液作為對照藥材溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典》(一部)附錄ⅥB]試驗，吸取供試品溶液及陰性對照品溶液各5～10 μL、對照藥材溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水(30∶8∶1)10℃以下放置的下層溶液為展開劑，10℃以下飽和30 min，展開，取出，晾干，噴以對二甲氨基苯甲醛－10%硫酸乙醇(5∶100)溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上至少顯一個相同顏色的主斑點陰性對照品溶液對鑒別無干擾(圖1 B)。

白芍:按處方比例取缺白芍的藥材，依照制備工藝制得白芍空白樣品，按柴胡供試品溶液制備法操作，即得陰性對照品溶液。取芍藥苷對照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典》(一部)附錄ⅥB]試驗，吸取柴胡鑒別項下的供試品溶液及陰性對照品溶液各5～10 μL、對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，熱風吹至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照品溶液對鑒別無干擾(圖1 C)。

益母草:取本品10粒的內(nèi)容物，加熱水30 mL溶解，脫脂棉濾過，放冷，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至1～2，通過已處理好的強酸性陽離子樹脂柱(內(nèi)徑1.5 cm，柱高15 cm)，先用水洗脫至流出液無色，再用氨試液100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣先加乙醇2 mL再加5滴鹽酸使溶解，作為供試品溶液。按處方比例取缺益母草的藥材，依照制備工藝制得益母草空白樣品，按供試品溶液制備法操作，即得陰性對照品溶液。另取鹽酸水蘇堿對照品，加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典》(一部)附錄ⅥB]試驗，吸取供試品溶液及陰性對照品溶液各5～10 μL、對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇－鹽酸－乙酸乙酯(8∶3∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液，熱風吹至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照品溶液對鑒別無干擾(圖1 D)。

澤瀉:取本品10粒的內(nèi)容物，研細，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。按處方比例取缺澤瀉的藥材，依照制備工藝制得澤瀉空白樣品，按供試品溶液制備法操作，即得陰性對照品溶液。另取澤瀉對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典》(一部)附錄ⅥB]試驗，吸取供試品溶液及陰性對照品溶液各5～10 μL、對照藥材溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯(5∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，熱風吹至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯一個相同顏色的主斑點，陰性對照品溶液對鑒別無干擾(圖1 E)。

圖1 薄層色譜鑒別圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);檢測波長:318 nm;流動相:乙腈－0.1%磷酸溶液(13∶87);流速:1.0 mL/min;柱溫:室溫;理論板數(shù)以阿魏酸峰計算不低于5000[1－3]。

2.2.2 溶液制備

取阿魏酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含6μg的溶液，作為對照品溶液。取本品內(nèi)容物，研細，取0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 KHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。另按處方比例取缺當歸的藥材，依照制備工藝制得陰性樣品，按供試品溶液制備法操作，即得陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗:取2.2.2項下3種溶液，按擬訂的色譜條件進樣測定，色譜圖見圖2。陰性對照品溶液對測定無干擾。

圖2 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密吸取不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，注入高效液相色譜儀，以峰面積積分值為縱坐標(Y)、進樣量為橫坐標(X)，繪制標準曲線。得回歸方程為 Y=5.77560903 X+2.4960183(r=0.9999)。結(jié)果表明阿魏酸進樣量在 25.15 ～201.2 ng范圍內(nèi)與峰面積積分值具有良好線性關(guān)系。

精密度試驗:精密吸取對照品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進樣測定。結(jié)果峰面積的 RSD為0.16%(n=5)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:吸取同一供試品溶液，分別于 0，2，6，12，24 h時進樣，測定峰面積。結(jié)果的 RSD為0.87%，表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

重復性試驗:取同一批樣品，分別取高、中、低3個樣品量，每個樣品量3份，按供試品溶液的制備方法制備，測定。結(jié)果含量(mg/g)平均值為0.3128，RSD為2.18%(n=9)，表明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗:將阿魏酸按高、中、低3個量級加入，同一量級平行操作2份，按供試品溶液的制備方法處理后，依法測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 阿魏酸加樣回收試驗測定結(jié)果(n=6)

2.2.4 樣品含量測定

按上述色譜條件，依法測定3批樣品中阿魏酸的含量。結(jié)果批號分別為090901，090902，090903的樣品中阿魏酸含量分別為0.2393，0.1901，0.2485 mg/g。

3 討論

該質(zhì)量標準鑒別部分，操作簡單，結(jié)果斑點清晰，分離度好，專屬性強。當歸為方中的君藥，故以阿魏酸作為含量測定指標，結(jié)果樣品處理方法簡便，精密度、重現(xiàn)性好，可以有效地控制產(chǎn)品的質(zhì)量。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:124.

[2]董曉燁，尹 華，周愛珍.RP－HPLC法測定骨健口服液中阿魏酸的含量[J].中國藥品標準，2007，8(1):59－62.

[3]蘭作平，覃樹勇，吳朝荔，等.高效液相色譜法測定婦月康膠囊中阿魏酸的含量[J].中國藥業(yè)，2008，17(15):40－41.