蔣桂香 ，呂應(yīng)年 ，范世錦 ，仲麗萍 ，崔 燎

1.廣東雙林生物制藥有限公司，湛江市生物制藥工程中心，廣東湛江 524005；2.廣東醫(yī)學(xué)院，廣東天然藥物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524023

丹參為唇形科鼠尾草植物的干燥根部，丹參的有效成分包含脂溶性的蒽醌類成分和水溶性的酚酸類成分[1]。丹參中的有效成分能增加冠脈血流量，降血脂，抑制血栓形成，改善微循環(huán)[2-3]，臨床常用于心血管疾病的治療，如市售的復(fù)方丹參片、丹參滴丸等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，丹參水溶性活性成分具有抗骨質(zhì)疏松的作用[4]，其中，丹參素可有效預(yù)防糖皮質(zhì)激素引起的大鼠骨質(zhì)疏松，丹參素可增加大鼠成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶（ALP）和骨鈣素含量，提高成骨細(xì)胞（osteoblast，OB）體外礦化能力，使骨保護(hù)蛋白基因表達(dá)增多，在促使骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的同時(shí)，抑制其向脂肪細(xì)胞分化[5]。丹參酚酸B具有相似的作用[6]。在上述藥理學(xué)研究的基礎(chǔ)上，本課題組研究了丹參水溶性成分用于治療糖皮質(zhì)激素型骨質(zhì)疏松的新方法，開(kāi)發(fā)成功抗骨質(zhì)疏松的中藥新藥——丹參骨寶，其主要成分為丹參水溶性成分丹酚酸B、丹參素等[7]。該制劑的質(zhì)量控制方法尚未建立。本文采用TLC法鑒別丹參骨寶顆粒中的丹參藥材，采用HPLC法同時(shí)測(cè)定其中的丹參素和丹酚酸B的含量，建立了一種準(zhǔn)確的含量測(cè)定方法，可有效控制丹參骨寶顆粒中有效成分的含量。

1 儀器和試藥

LC1200型高效液相色譜，包括四元泵、DAD檢測(cè)器、在線脫氣機(jī)、LC1200中文工作站（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；AE204型十萬(wàn)分之一分析天平（瑞士梅特勒公司）；MILLI—Q超純水制備儀（美國(guó)密理博科技公司）；四用紫外分析儀（上海顧村儀器廠）；GF254預(yù)制薄層硅膠板（青島海洋化工廠分廠）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

丹參素對(duì)照品、丹參酚酸B對(duì)照品（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所）；丹參骨寶顆粒（本室自制，規(guī)格為每袋3.0 g，批號(hào)分別為 091011、091012、091013）。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

本品為棕黃色顆粒，有獨(dú)特香氣味，規(guī)格為每袋3.0 g。

2.2 薄層色譜鑒別

采用TLC法[8]進(jìn)行薄層色譜的鑒別。取本品1 g，加75%甲醇20 m1，超聲20 min，濾過(guò)，濾液濃縮定容至5 ml，作為供試品溶液；取丹酚酸B對(duì)照品，加75%甲醇制成每毫升含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；取不含丹參的空白顆粒樣品，同法制成缺丹參的陰性對(duì)照溶液。按照《中國(guó)藥典》2010年版薄層色譜法（附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2.0∶3.0∶4.0∶0.5∶2.0）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品TLC色譜中，在與丹參酚酸B對(duì)照品相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 供試品、丹酚酸B對(duì)照品、陰性對(duì)照溶液TLC色譜

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 供試品溶液的制備 取研細(xì)的樣品0.3 g，精密稱定，加入20%甲醇25 ml，稱重，超聲10 min，放冷至室溫，用流動(dòng)相補(bǔ)足減失的重量，0.45 μm膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取丹參素鈉、丹酚酸B對(duì)照品適量，置于25 ml容量瓶中，用20%甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度分別為152 μg/ml和292 μg/ml的對(duì)照品混合液。

2.3.3 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱為Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A 相）-0.5%冰醋酸水溶液（V/V，B 相）進(jìn)行線性梯度洗脫：0～9 min：10%A，9～20 min：10%A～60%A，20～30 min：60%A～10%A；檢測(cè)波長(zhǎng)為 281 nm；流速為1.0 ml/min；柱溫為30℃。在上述色譜條件下，取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各20 μl，分別進(jìn)樣，HPLC分析，記錄色譜圖。丹參素和丹參酚酸B的理論塔板數(shù)大于5000。試驗(yàn)結(jié)果表明，色譜系統(tǒng)適應(yīng)性良好。陰性對(duì)照無(wú)顯著色譜峰，表明空白溶劑不干擾樣品的檢測(cè)。見(jiàn)圖2。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6 ml，分別置于 10 ml量瓶中，加甲醇定容到刻度，搖勻即得系列濃度的對(duì)照品溶液。分別取配制好的各濃度對(duì)照品溶液20 μl，依次進(jìn)樣，記錄峰面積積分值。以進(jìn)樣含量X（μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)計(jì)算得丹參素的線性回歸方程為Y=0.08452X+0.368（r=0.9996），丹參酚酸B的線性回歸方程為Y=0.07857X+0.682（r=0.9998）。計(jì)算結(jié)果表明丹參素和丹參酚酸B分別在 3.0～24.0 μg/ml和 6.0～48.0 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 供試品、對(duì)照品、陰性對(duì)照溶液高效液相色譜

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液，按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣量20 μl，以各藥物成分峰面積計(jì)算RSD。計(jì)算得丹參素和丹參酚酸B的日內(nèi)精密度RSD分別為1.20%和0.68%，表明試驗(yàn)方法精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的樣品，按照供試品溶液配制方法，制備6份供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算丹參素和丹參酚酸B的含量分別為0.26 μg/ml和5.63 μg/ml，RSD分別為1.60%和0.94%，表明該試驗(yàn)方法的重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取相同供試品溶液，分別在0、1、2、4、6 h進(jìn)樣測(cè)定丹參素和丹參酚酸B的峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果兩種藥物成分的RSD分別為1.30%和0.86%，表明供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品，配制成一定濃度的供試品溶液，分別加入丹參素和丹參酚酸B的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件測(cè)定并計(jì)算回收率。見(jiàn)表1。

2.3.9 樣品含量測(cè)定 取3個(gè)批號(hào)的樣品，按照供試品溶液配制方法操作，進(jìn)樣20 μl，按色譜條件測(cè)定峰面積，外標(biāo)法計(jì)算樣品標(biāo)示的百分含量。見(jiàn)表2。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

在薄層色譜鑒別試驗(yàn)中，本文參照《中國(guó)藥典》2010年版丹參的鑒別方法[8]進(jìn)行。由于本品主要含丹參水溶性成分，不含丹參脂溶性成分（如丹參酮等），因此在此研究中將方法略作修改，藥典中75%甲醇溶解改為20%甲醇，主要是增加水溶性成分的溶解度，提高測(cè)定的準(zhǔn)確性。

在HPLC試驗(yàn)中，對(duì)藥劑成分丹參素和丹參酚酸B做紫外光譜掃描發(fā)現(xiàn)，丹參素的最大吸收波長(zhǎng)是281 nm，丹參酚酸B的最大吸收波長(zhǎng)是286 nm。由于制劑中丹參素的含量較小，為提高準(zhǔn)確性，選擇測(cè)定波長(zhǎng)為281 nm。結(jié)果表明在該條件下，兩種有效成分的檢測(cè)線性關(guān)系良好。

在HPLC試驗(yàn)中，由于樣品物質(zhì)丹參素和丹參酚酸B的化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有酸性羧基，在酸性流動(dòng)相中色譜峰的對(duì)稱性良好，峰形尖銳，有利于防止拖尾，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)在流動(dòng)相中添加0.5%的冰醋酸能取得較好的峰形效果。

在本制劑中，丹參骨寶水溶性有效成分丹參素及丹參酚酸B的含量較高。丹參素是多羥基酚酸，在空氣中加熱易氧化，丹參酚酸B是由三分子的丹參素和一分子的咖啡酸結(jié)合而成，在有效成分提取、濃縮及制劑過(guò)程中，應(yīng)嚴(yán)格控制各環(huán)節(jié)工藝參數(shù)，防止丹參酚酸B的分解以及丹參素的氧化，以保證制劑具有較高的水溶性活性成分含量。

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