李成艦，陳海洋，賀百花，高 倩，趙紅深

湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥系，湖南衡陽(yáng) 420001

腸健片是中藥復(fù)方制劑，主要由黃連、木香、吳茱萸（制）等制備而成，該方主要用于腸道疾病，經(jīng)過(guò)多年的臨床驗(yàn)證，其治療效果非常顯著。為了進(jìn)一步對(duì)該藥的作用機(jī)制進(jìn)行了解和探索，筆者以小檗堿與木香烴內(nèi)酯的含量及干浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)結(jié)合多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)化醇提工藝并對(duì)該制劑中所含藥物的主要藥理活性成分進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 儀器與試藥

1.1 材料

黃連等中藥材（由四川省天奇藥業(yè)有限公司提供）；鹽酸小檗堿對(duì)照品 （由北京太洋藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)：H11021511）；木香烴內(nèi)酯對(duì)照品（由上?？婆d實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司提供，批號(hào)：111524-200503）；以甲醇、乙腈作為色譜純，采用重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

Waters高效液相色譜儀；Waters 2487型紫外檢測(cè)器；色譜柱：Polaris C18－A 色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；Breeze工作站；C-R3A數(shù)據(jù)處理器；電子分析天平（MA11O型，上海天平儀器廠）

2 方法與結(jié)果

按照《中國(guó)藥典》規(guī)定的方法，對(duì)藥材中的指標(biāo)成分分別測(cè)定[1]。木香中木香烴內(nèi)酯與去氫木香烴內(nèi)酯總浸出量為1.9%；黃連中鹽酸小檗堿浸出量為6.1%，均符合藥典規(guī)定的要求。

2.1 干浸膏得率的測(cè)定[1]

首先取25.00 ml提取液，置于干燥蒸發(fā)皿中，溫度調(diào)節(jié)為105℃，水浴蒸干并真空干燥3 h，干燥后移至器皿中，冷卻30 min后稱(chēng)定重量（W）。

2.2 小檗堿浸出量的測(cè)定[2]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Polaris C18-A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸二氫鈉（用磷酸調(diào)節(jié)pH至3）-乙腈（70∶30）；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿加65%乙醇配制成0.05 mg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備與測(cè)定 取4倍處方量藥材（其中含黃連24 g，木香40 g）置于圓底燒瓶中，在水浴上加熱回流，提取 3次，加入65%乙醇分別為600﹑480﹑480 ml，提取時(shí)間分別為2.0﹑1.5﹑1.5 h，濾過(guò)，合并濾液。取提取液減壓濃縮至適量并用相同的溶劑定容至1000 ml，精密取5 ml藥液后置于50 ml容量瓶中，并用相同的溶劑稀釋至刻度。搖勻后靜置，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。將上述供試品溶液、對(duì)照品溶液各10 μl注入高效液相色譜儀中檢測(cè)，以外標(biāo)法計(jì)算小檗堿含量。

2.3 木香烴內(nèi)酯浸出量的測(cè)定[3]

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Polaris C18-A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（65∶35）；檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取木香烴內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品，加入適量甲醇，配制成160 μg/ml的對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備與測(cè)定 按照“2.1.3”中供試品溶液的方法制備定容液1000 ml，精密吸取定容液5 ml置于25 ml量瓶中，用相同的溶劑稀釋至刻度，搖勻，靜置，取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

取對(duì)照品、供試品各10 μl注入色譜儀，測(cè)定其峰面積積分值，以外標(biāo)法計(jì)算木香烴內(nèi)酯的含量。

2.4 提取工藝條件的考察

2.4.1 提取次數(shù)的考察 稱(chēng)取4倍量的藥材（其中含黃連24 g，木香40 g）3份，采用65%的乙醇回流提取3次，溶劑量為8、6、6倍，提取時(shí)間為2 h，分別收集各次提取液，適當(dāng)濃縮并定容至1000 ml，備用。取定容溶液，按照前述方法分別測(cè)定鹽酸小檗堿與木香烴內(nèi)酯的浸出量，結(jié)果表明采用65%乙醇回流提取時(shí)，在第3次提取中鹽酸小檗堿與木香烴內(nèi)酯浸出量占總浸出量的8.65%與11.33%，故確定提取3次。

2.4.2 正交試驗(yàn)優(yōu)選乙醇提取工藝條件 各因素分別設(shè)計(jì)3個(gè)水平，見(jiàn)表1。取4倍處方量藥材（含黃連24 g，木香40 g），共9份，用L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，以小檗堿與木香烴內(nèi)酯的浸出量和干浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。見(jiàn)表2。

表1 因素水平

2.5 數(shù)據(jù)處理與試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)表2中的結(jié)果用多指標(biāo)試驗(yàn)全概率方法進(jìn)行數(shù)理處理[4]。 設(shè) Bi為第 i號(hào)實(shí)驗(yàn)，Aj為第 j個(gè)指標(biāo)，i＝1、2、3…n；j＝1、2、3…k，并且 A1、A2…Ak互不相容，又設(shè)各指標(biāo)的重要程度之比為 A1∶A2∶…∶Ak＝m1∶m2∶…∶mk，設(shè) N＝m1＋m2＋…＋mk，則：

表2 正交試驗(yàn)安排及結(jié)果

以Xji表示第j個(gè)指標(biāo)的第i個(gè)測(cè)定值，以Sj表示第j個(gè)指標(biāo)下各次（n次）實(shí)驗(yàn)結(jié)果的和，即：

SS＝∑Xji，其中 i＝1、2、3…n；j＝1、2、3…k；則：

于是由全概率公式得：

公式③即為同時(shí)兼顧各指標(biāo)綜合效應(yīng)的全概率公式。按照m1-m2-m3（小檗堿含量指標(biāo)權(quán)重∶木香烴內(nèi)酯含量指標(biāo)權(quán)重∶浸膏得率指標(biāo)權(quán)重）=2∶2∶1 計(jì)算 P（Aj）＝mj/N。三指標(biāo)的 P（Bi/Aj）＝Xji/Sj列于相應(yīng)各指標(biāo)的右側(cè)，則同時(shí)兼顧各指標(biāo)效應(yīng)的全概率公式分為：P（Bi）=0.4P（Bi/A1）＋0.4P（Bi/A2）＋0.2P（Bi/A3）， i＝1、2、3…9，結(jié)果見(jiàn)表 2。對(duì)表 2 中的全概率計(jì)分（P 值）進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表2與表3可知，最佳的提取方案為A2B1C2D3，與表2中正交試驗(yàn)的No.4方案一致，從而使正交試驗(yàn)得以驗(yàn)證。因此最佳提取工藝條件確定為A2B1C2D3，即用含1%硫酸的65%乙醇溶液提取3次，加溶劑量為12﹑10﹑10倍，提取時(shí)間分別為 2.0﹑1.5﹑1.5 h。

表3 正交試驗(yàn)方差分析

3 討論

黃連與木香為本復(fù)方制劑處方中的重要藥物，故選擇其相應(yīng)的藥理活性成分小檗堿與木香烴內(nèi)酯作為該醇提工藝的考察評(píng)價(jià)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的木香烴內(nèi)酯含量實(shí)際為木香烴內(nèi)酯與去氫木香烴內(nèi)酯的總量。

關(guān)于黃連中小檗堿的提取方法很多[5]，劉圣等[6]通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，由于小檗堿的硫酸鹽溶解度較大，黃連提取采用酸性溶劑能增加小檗堿的浸出量，但硫酸加入量從0.1%到1.0%不等，故本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)報(bào)道[5]中小檗堿提取方法并進(jìn)行改良，對(duì)提取液中加入的酸的用量進(jìn)行考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法能有效增加小檗堿在復(fù)方混合提取中的浸出量，提示該方法相對(duì)有效。

中試產(chǎn)品檢驗(yàn)結(jié)果顯示，不同批次的產(chǎn)品中指標(biāo)成分的含量基本一致，小檗堿浸出量為75%左右，木香烴內(nèi)酯浸出量為62%左右，提示該提取方法提取效果較好，且相對(duì)穩(wěn)定，說(shuō)明本試驗(yàn)方法較傳統(tǒng)方法更加快捷、全面、合理。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:57-58,285-285.

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[4]石召華,翟莉,曾慶恢,等.用多指標(biāo)試驗(yàn)全概率評(píng)分法研究?jī)簽a貼提取工藝[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2008,17(28):1453-1455.

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[6]劉圣,唐麗琴,陳禮明.正交試驗(yàn)優(yōu)選黃連中小檗堿提取工藝的研究[J].中國(guó)藥房,2004,15(1):18-20.

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