由莉越 ，遲淑萍 ，汪 辰 ，孫 杰 ，周婷婷 ，陳紅鴿 ，趙慶國(guó) ，程 云 *

1.解放軍第三〇二醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100039；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）所引起，是危害人類(lèi)健康的重要疾病之一，其中有很大一部分患者最終發(fā)展為肝硬化和肝癌[1]。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)于丙型肝炎慢性化和肝損傷的機(jī)制一直都在探討之中[2]，在丙型肝炎的診斷和預(yù)后效果判斷的過(guò)程中，肝生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果具有很重要的參考價(jià)值。此外，細(xì)胞因子重組人干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、 腫瘤壞死因子 α （tumor necrosis factor，TNF-α）、重組人白介素10（interleukin-10，IL-10）都是細(xì)胞免疫應(yīng)答過(guò)程中合成分泌的細(xì)胞因子，它們同其他細(xì)胞因子形成細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，對(duì)免疫應(yīng)答進(jìn)行調(diào)節(jié)，同時(shí)也參與炎癥反應(yīng)，是重要的炎癥介質(zhì)。本研究采用酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定（ELISA）方法檢測(cè)丙型肝炎患者血清中IFN-γ、IL-10、TNF-α的表達(dá)水平，探討3種細(xì)胞因子之間以及其與生化變量之間的相關(guān)性，有助于進(jìn)一步了解HCV引起肝臟損傷的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

慢性HCV感染者的66份外周血均采自解放軍第三〇二醫(yī)院2005年1月～2006年1月的住院確診的患者。其中，男32 例，女 34例；年齡 7～77 歲，平均（51.5±18.5）歲；27 例有輸血史。HCV感染的診斷根據(jù)血清抗-HCV和（或）HCV RNA檢測(cè)陽(yáng)性。按照2005年第11次全國(guó)病毒性肝炎會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為輕度慢性肝炎33例，中重度慢性肝炎8例，代償期肝硬變13例，失代償期肝硬變12例。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）提取后，將分離所得PBMCs用含有100 ml/L的混合人血清的完全RPMI 1640培養(yǎng)，稀釋細(xì)胞使其終濃度為5×107/ml，以100 μl/孔加入96孔板，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，72 h后收集培養(yǎng)上清，采用ELISA方法檢測(cè)上清細(xì)胞因子IFN、IL-10、TNF-α的含量。操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 以患者血清為模板，提取HCV RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后在AG-600型DNA擴(kuò)增儀上進(jìn)行兩輪巢式PCR循環(huán)，具體的PCR引物以及擴(kuò)增條件參考我院之前的研究結(jié)果[3]，最后利用PE 310全自動(dòng)遺傳分析儀進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)各生化變量之間、各細(xì)胞因子之間以及各生化變量與各細(xì)胞因子之間的相關(guān)性進(jìn)行皮爾森（Pearson）相關(guān)性分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果相關(guān)系數(shù)≥0.8，高相關(guān)性；0.5≤相關(guān)系數(shù)<0.8，中相關(guān)性；0.3≤相關(guān)系數(shù)<0.5，低相關(guān)性；相關(guān)系數(shù)<0.3，非常低相關(guān)性，可以認(rèn)為不相關(guān)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

本研究共檢測(cè)生化指標(biāo)8項(xiàng)，其中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（ALT）、 天門(mén)冬酸氨基轉(zhuǎn)換酶 （AST）、ALT/AST、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、清蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）七項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)了66例患者，CHE指標(biāo)檢測(cè)了46例患者，各變量檢測(cè)結(jié)果，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如下：ALT（81.0±72.4）U/L、AST（65.2±46.5）U/L、ALT/AST（0.95±0.47）、TBIL（12.95±6.31）U/L、DBIL（3.09±2.16）U/L、ALB（44.14±3.03）U/L、GLO（30.24±5.78）U/L、CHE（7108.6±1724.3）U/L。

2.2 細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果

在本研究中檢測(cè)了3種細(xì)胞因子的表達(dá)水平，66例患者中有34例檢測(cè)了細(xì)胞因子IFN-γ及IL-10表達(dá)水平，同時(shí)該34例患者中有33例同時(shí)檢測(cè)了細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)水平。結(jié)果顯示IFN-γ表達(dá)的平均水平為（76.9±112.3）ng/L，IL-10 表達(dá)的平均水平為（1596.4±1313.4）ng/L，TNF-α 平均表達(dá)水平為（4253.8±4557.4）ng/L。

2.3 各生化變量與細(xì)胞因子間的相關(guān)性分析

各生化變量與細(xì)胞因子間的相關(guān)性較差，除GLO與TNF-α在 0.05置信水平上有較低相關(guān)性 （r=-0.287，P=0.046）之外（圖1），丙肝患者各血生化指標(biāo)與各炎癥細(xì)胞因子之間無(wú)顯著相關(guān)性（P＜0.05）。

圖1 GLO-TNF相關(guān)性散點(diǎn)圖

2.4 各生化指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

通過(guò)各生化指標(biāo)之間的相關(guān)性分析可以看出各指標(biāo)之間存在微弱互相關(guān)性。其中ALT與AST具有顯著相關(guān)性（r=0.869，P=0），但是做除法后（ALT/AST）相關(guān)性基本被消除，僅存在ALT與ALT/AST的中度相關(guān)（r=-0.370，P=0.002）。另外，ALT與GLO在0.05水平正相關(guān)，但是相關(guān)性非常低 （r=0.283，P=0.021）。對(duì)于AST而言，除了與ALT高度相關(guān)之外，還與 DBIL（r=0.281，P=0.022）和 GLO（r=0.427，P=0）具有相關(guān)性；對(duì)于ALT/AST而言，除與ALT中度相關(guān)外，還與CHE在0.01 水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.417，P=0.004），但相關(guān)性低；對(duì)于TBIL 而言，與 DBIL 在 0.01水平呈正相關(guān)（r=0.732，P=0），且為中度相關(guān)性；對(duì)于ALB而言，與GLO在0.01水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.461，P=0），且相關(guān)性低。

2.5 細(xì)胞因子間的相關(guān)性分析

細(xì)胞因子間的相關(guān)性分析顯示除IFN-γ與TNF-α之間存在弱相關(guān)性（r=0.448，P=0.009）之外（圖 2），各細(xì)胞因子表達(dá)水平之間無(wú)明顯相關(guān)性（P＜0.05）。

3 討論

圖2 IFN-TNF相關(guān)性散點(diǎn)圖

丙型肝炎是由丙肝病毒所引發(fā)，通過(guò)輸血或血制品、血透析、腎移植、靜脈注射毒品、性傳播、母嬰傳播等傳染引起的。有研究證明，HCV感染者病程進(jìn)展與諸多因素有關(guān)，包括性別、感染HCV的年齡、過(guò)度飲酒、脂肪變性、合并感染HBV/HIV、免疫抑制（如器官移植）等[4-5]。在臨床診斷其疾病以及疾病發(fā)展過(guò)程中，肝功能檢查是很重要的一項(xiàng)判斷指標(biāo)。Zechini等[6]認(rèn)為，ALT水平，特別是AST的水平，與肝損傷的程度有關(guān)。而有研究[7]則認(rèn)為，肝損傷程度與臨床癥狀、ALT水平、HCV基因型和病毒載量不相關(guān)。Anand等[8]和Rehermann[9]報(bào)道在慢性丙型肝炎患者中AST/ALT比值是判斷纖維化分期和肝硬化的一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)，當(dāng)AST/ALT≥1時(shí)，高度提示肝硬化的存在。慢性肝炎中度以上、肝硬化、重型肝炎時(shí)出現(xiàn)白蛋白下降，γ球蛋白升高，白/球（A/G）比例下降甚至倒置。一般情況下，肝損程度與膽紅素含量呈正相關(guān)。DBIL在TBIL中的比例尚可反映淤膽程度。本研究中，對(duì)各生化變量之間進(jìn)行相關(guān)性分析后，除了ALT與AST具有高顯著相關(guān)性之外，其余的生化變量之間存在弱的相關(guān)性，而且在對(duì)ALT、AST做除法后（ALT/AST）相關(guān)性基本被消除，這就提示在對(duì)疾病作判斷時(shí)不能單純地看某一指標(biāo)，必須綜合考慮。

以往的研究認(rèn)為慢性丙型肝炎肝損傷的發(fā)病機(jī)制是HCV與宿主免疫反應(yīng)之間相互作用的結(jié)果[9]。細(xì)胞免疫在HCV感染中具有雙重作用，HCV感染機(jī)體后，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的Th1類(lèi)細(xì)胞因子，其中就包括IFN-γ和TNF-α，這兩種細(xì)胞因子同時(shí)具有抗病毒和誘發(fā)炎癥的作用，雖然不足以清除病毒，但仍可誘導(dǎo)機(jī)體的肝臟損傷[10]。Yoshioka等[11]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)量的TNF與暴發(fā)型病毒性肝炎和慢性活動(dòng)性肝炎相關(guān)，其本身對(duì)感染的肝細(xì)胞也有直接的溶解破壞作用。以往的研究也顯示，IFN-γ在清除病毒中起重要作用，TNF-α是引起肝臟損傷的重要因素之一[12]。IL-10屬于細(xì)胞因子中的干擾素家族，最初認(rèn)為是由Th2淋巴細(xì)胞分泌的，能抑制 Th1 細(xì)胞合成 IFN-γ、白介素 2（interleukin-2，IL-2），故曾被命名為細(xì)胞因子合成抑制因子 （cytokine synthesis inhibiting factor，CSIF）。IL-10也能抑制炎癥因子的合成與釋放，de Waal等[13]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性與外源性IL-10均能在轉(zhuǎn)錄水平強(qiáng)烈抑制 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α 的合成，從而起到抗炎癥的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，IFN與TNF之間存在弱相關(guān)性，而且球蛋白（GLO）與TNF在0.05置信水平上有較低相關(guān)性。提示IFN與TNF可以相互誘導(dǎo)表達(dá)，以促進(jìn)HCV的清除，同時(shí)，TNF的表達(dá)引起肝臟損害的機(jī)制可能是通過(guò)GLO這個(gè)生化指標(biāo)表現(xiàn)出來(lái)。為了更好地分析各生化變量及細(xì)胞因子之間的關(guān)系，下一步筆者將擴(kuò)大樣品數(shù)，以進(jìn)行更深入細(xì)致的分析。

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