薛金俊，袁 昕，殷旭東，汪 瑞，張正榮，夏廣鑫

江蘇省揚(yáng)州市第一人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇揚(yáng)州 225009

食管癌是我國(guó)高發(fā)惡性腫瘤之一，因早期癥狀不明顯，大部分患者確診時(shí)已屬中晚期，如何提高食管癌早期診斷率和改善中晚期患者療效是亟待解決的重要課題。研究表明，腫瘤細(xì)胞在其早期階段就可能進(jìn)入血液循環(huán)，而患者常無任何臨床表現(xiàn)，常規(guī)檢測(cè)手段亦不能發(fā)現(xiàn)，即腫瘤微轉(zhuǎn)移（micrometastasis）[1]。 目前，循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTC）已成為腫瘤早期診斷、預(yù)后判斷及療效評(píng)估的重要手段[2]。 癌胚抗原（carcinogenic embryonic antigen，CEA）是一分子量為20萬左右的糖蛋白，特異性地表達(dá)于上皮組織及其起源的腫瘤組織，而外周血中無上皮細(xì)胞，故可視為CTC標(biāo)記[3]。本研究應(yīng)用巢式RT-PCR技術(shù)檢測(cè)72例根治性放療食管癌患者外周血中CEA mRNA的表達(dá)，并與臨床常用的血清CEA蛋白檢測(cè)進(jìn)行比較。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年3月～2009年3月在我院行根治性放療食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）患者72例，其中，男54例，女18例；年齡46～83歲，中位年齡63歲；原發(fā)腫瘤部位：胸上段15例，胸中段46例，胸下段11例。根據(jù)放療前影像學(xué)檢查結(jié)果，依照我國(guó)《非手術(shù)治療食管癌的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)（草案）》[4]分期：其中，Ⅰ期8例，Ⅱ期37例，Ⅲ期27例。入組條件符合以下標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)胃鏡病理檢查確診；均為初治患者；無放療禁忌證；無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；KPS評(píng)分≥70分；預(yù)計(jì)生存期≥3個(gè)月；實(shí)驗(yàn)室檢查主要指標(biāo)無異常。所有患者采用6 MV-X射線，2.0 Gy/次，5次/周，總劑量60～70 Gy，分30～35次完成放療計(jì)劃。放療結(jié)束后采用RECIST實(shí)體瘤療效標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)[5]，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩(wěn)定（SD）、進(jìn)展（PD），有效率=[（CR+PR）/總例數(shù)]×100%。

1.2 試劑與儀器

淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海華精生物科技公司；Trizol細(xì)胞裂解液購(gòu)自Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒和DNA Marker購(gòu)自Takara公司；基因引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成；梯度PCR儀和分光光度計(jì)為Eppendorf公司產(chǎn)品；凝膠電泳成像系統(tǒng)為上海培清科技有限公司產(chǎn)品。CEA蛋白水平來自我院核醫(yī)學(xué)科檢查報(bào)告（≥3.5 μg/L為陽性結(jié)果），測(cè)定儀器為Roche Diagnostics全自動(dòng)免疫分析儀。

1.3 標(biāo)本處理及RNA提取

放療前及放療結(jié)束兩周內(nèi)留取外周血10 ml（EDTA抗凝），采用淋巴細(xì)胞分離液分離單核細(xì)胞，生理鹽水洗滌后置于-80℃冰箱備用。同期收集20例食管良性疾病患者外周血及10例食管癌術(shù)后組織標(biāo)本作為對(duì)照。采用Trizol一步法提取細(xì)胞和組織的總RNA，無RNA酶的DNase去除混雜的DNA，紫外分光光度計(jì)定量。

1.4 巢式RT-PCR

取1～2 μg總RNA，70℃ 5 min預(yù)變性后，依試劑盒說明進(jìn)行cDNA合成。繼而取4 μl cDNA行第1輪PCR擴(kuò)增，取第1輪PCR產(chǎn)物0.5 μl行第2輪PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括 10×PCR buffer 2.5 μl（含 Mg2+，終濃度在 1.5 mmol/L），dNTP mixture 2.5 μl（終濃度 250 μM/L），上下游引物各 2 μl（20 pmol），Taq 酶 0.15 μl，滅菌去離子水補(bǔ)足至 25 μl。 引物序列及反應(yīng)條件參見文獻(xiàn)[6]。取第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，率的比較采取χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，診斷效能通過受試者特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線分析。 P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 放療前CEA mRNA、蛋白表達(dá)

CEA mRNA檢測(cè)典型PCR結(jié)果如圖1所示。72例食管癌患者中，放療前CEA mRNA陽性者為34例（47.2%，敏感性），血清CEA蛋白升高者為16例（22.2%，敏感性）；而20例食管良性疾病患者外周血CEA mRNA陽性者為0例（100%，特異性），CEA蛋白升高者為2例（90%，特異性）。10例食管癌術(shù)后組織標(biāo)本CEA mRNA表達(dá)均為陽性。CEA mRNA與CEA蛋白診斷食管癌的Youden指數(shù)（Youden指數(shù)是將靈敏度與特異度綜合起來評(píng)價(jià)某種檢查方法的真實(shí)性的指標(biāo)，指數(shù)范圍為0～1，Youden指數(shù)越大，真實(shí)性越大）分別為0.472與 0.122，ROC 曲線下面積（area under the curve，AUC）分別為0.736與0.561（圖 2），可見 CEA mRNA的診斷效能顯著優(yōu)于血清CEA蛋白。

2.2 CEA mRNA、蛋白表達(dá)的臨床病理聯(lián)系

放療前CEA mRNA陽性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P=0.046），與年齡、性別、腫瘤位置、病變長(zhǎng)度、分期等因素?zé)o關(guān)；而血清CEA蛋白水平升高與食管癌臨床病理特征均無關(guān)。見表1。

2.3 CEA mRNA、蛋白變化與放療療效的關(guān)系

圖2 食管癌外周血癌胚抗原mRNA與蛋白檢測(cè)的診斷效能

表1 食管癌外周血癌胚抗原mRNA、蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

放療結(jié)束后評(píng)價(jià)，CR 8例，PR 39例，SD 20例，PD 5例，放療前CEA mRNA、蛋白水平與放療有效率無關(guān)，而放療后CEA mRNA、蛋白變化與放療療效有關(guān)，CEA mRNA由陽性轉(zhuǎn)陰或血清CEA蛋白水平下調(diào)提示放療緩解率較好。見表2。

3 討論

放射治療是食管癌治療的主要手段之一，由于食管的組織結(jié)構(gòu)和自身生物學(xué)等方面的特點(diǎn)，相當(dāng)一部分食管癌患者不宜手術(shù)或不愿手術(shù)而接受放射治療。但多年來食管癌的放射治療效果尚不理想，5年生存率不足10%，失敗原因主要是局部未控或復(fù)發(fā)[7]，而腫瘤微轉(zhuǎn)移可能在其中起到關(guān)鍵作用。因此，若能及時(shí)監(jiān)測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC），將對(duì)食管癌早期診斷及指導(dǎo)臨床治療具有重要價(jià)值[2]。由于受到人體免疫系統(tǒng)的清除，存活的CTC數(shù)量極少，對(duì)檢測(cè)方法要求較高。RT-PCR技術(shù)具有高度靈敏性，可鑒別106～107個(gè)正常細(xì)胞中的一個(gè)腫瘤細(xì)胞，是目前最常用的方法[8]。

表2 食管癌外周血癌胚抗原mRNA、蛋白表達(dá)與放療療效的關(guān)系[n（%）]

血清CEA是食管癌常用的腫瘤標(biāo)記物之一，但一直存在敏感性低、特異性差的問題。近年來，以CEA mRNA為標(biāo)記的CTC檢測(cè)則展示出較好的前景，在乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌和宮頸癌等多種惡性腫瘤中得到廣泛應(yīng)用[3]。如Qiu等[9]報(bào)道，103例胃癌外周血CEA mRNA陽性占36.6%，CEA mRNA表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度和術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)，并且，CEA mRNA比血清CEA蛋白在預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)方面具有更好的敏感性。Ishigami等[10]則發(fā)現(xiàn)，胃癌外周血CEA mRNA拷貝數(shù)而非陽性率與術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)。在食管癌中，Nakashima等[11]報(bào)道，外周血CEA mRNA陽性占57.4%（31/54），且CEA mRNA陽性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)，而血清CEA水平與之無關(guān)。Liu等[12]應(yīng)用realtime PCR 檢測(cè)食管癌術(shù)前 1 d（B-1）、手術(shù)當(dāng)天（B0）和術(shù)后3 d（B+3）外周血中以CEA mRNA為標(biāo)記的CTC數(shù)目，發(fā)現(xiàn)B-1與B0，B-1與B+3間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且B+3/B0>0.4預(yù)示較高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)；Tanaka等[13]也發(fā)現(xiàn)以CEA mRNA和鱗狀細(xì)胞相關(guān)抗原 （SCC）mRNA為標(biāo)記的鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原（CTC）是食管癌術(shù)后無進(jìn)展生存的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。上述結(jié)果都證實(shí)外周血CEA mRNA檢測(cè)在食管癌中的應(yīng)用價(jià)值。

本研究結(jié)果表明，食管癌根治性放療前外周血CEA mRNA陽性與 CEA蛋白升高者分別占 47.2%（34/72）與22.2%（16/72），而食管良性疾病患者外周血CEA mRNA陽性與CEA蛋白升高者分別為0與10.0%（2/20），CEA mRNA的診斷效能顯著優(yōu)于CEA蛋白。且CEA mRNA陽性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān) （P=0.046），CEA蛋白升高與食管癌臨床病理特征無關(guān)，提示以CEA mRNA為標(biāo)記的CTC在食管癌預(yù)后中的潛在價(jià)值。同時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)放療前后CEA mRNA、蛋白變化與放療療效有關(guān)，CEA mRNA由陽性轉(zhuǎn)陰或CEA蛋白水平下調(diào)提示放療緩解率較好，推測(cè)是由于放療有效地減少腫瘤負(fù)荷，從而停止釋放癌細(xì)胞及癌相關(guān)抗原入血。

總之，外周血CEA mRNA陽性對(duì)于食管癌早期診斷及放療療效評(píng)估具有重要意義，如檢測(cè)方法進(jìn)一步得以改進(jìn)，使之更加方便并滿足定量需求，則可望成為替代血清CEA蛋白的有效分子標(biāo)記。

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