蘭志瓊 ，盧先明 ，陳繼蘭，周 毅，馬逾英，胡友福

1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，中藥材標準化教育部重點實驗室，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，四川 成都 611137

組織化學（histochemistry）是建立在形態(tài)學基礎之上的邊緣科學范疇，是研究細胞和組織中的化學組成、定位與定量以及代謝狀態(tài)的科學[1]。組織化學的不斷發(fā)展，為我們開展中藥活性成分的產生、分布和積累規(guī)律提供了新穎、科學、可靠的方法。

白芷始載于《神農本草經》，為常用的解表、止痛藥。現(xiàn)代研究結果表明，香豆素類化合物為白芷的主要有效成分之一。本文利用香豆素類成分的自發(fā)熒光性質，首次引入植物冰凍切片、熒光顯微技術等組織化學研究方法，確定香豆素類成分在白芷根中的積累部位，為進一步揭示白芷活性成分香豆素類及其積累規(guī)律與白芷組織結構及發(fā)育的關系奠定一定基礎。

1 儀器與試藥

冰凍切片機（CM-1900，Leica），電控型倒置熒光顯微鏡（DMIRE2，Leica），顯微攝影系統(tǒng)（DFC300，Laica）。

OCT包埋劑 （北京海德創(chuàng)業(yè)生物科技有限公司，批號：4583，118 ml/瓶），歐前胡素（寶雞辰光生物有限公司，批號：482-44-0。準確稱取歐前胡素0.1 mg，用甲醇溶解在10 ml量瓶中，定容即得歐前胡素溶液），無水乙醇、95%乙醇、甲醇、冰醋酸、福爾馬林、丙三醇均為分析純。

白芷根新鮮材料取自成都中醫(yī)藥大學（溫江校區(qū)）藥用植物園的栽培植物，經成都中醫(yī)藥大學馬逾英教授鑒定為傘形科植物杭白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.var.formosana（Boiss.）Shan et Yuan。 2011年 5月分3次取兩年生白芷根中部新鮮材料做正式實驗。

2 方法與結果

2.1 白芷根冰凍切片的制作

冰凍切片是利用低溫使組織迅速凍結達到一定硬度進行切片的一種方法[2]。該切片能更好地保存細胞內生物分子的活性，在組織化學、細胞免疫化學和原位雜交等研究中顯示出獨特作用。在動物和人體的研究中已被廣泛應用，但在植物上的應用相對較少，在中藥上的應用更是鮮見。因為與動物細胞相比，植物細胞有細胞壁和大液泡，含水量遠大于相同體積的動物細胞，冷凍后的植物樣品比動物樣品硬度大，難以切片和保持植物組織結構的完整性。而且，對于一棵完整的植物，不同部位的質地及含水量存在巨大差異，如何改進冰凍切片技術，使之適用于不同質地的材料，是冰凍切片技術在植物學研究應用中所面臨的一個重要問題。

首次開展白芷根橫切面的冰凍切片制作技術的系統(tǒng)研究，經過大量預實驗，發(fā)現(xiàn)影響白芷根冰凍切片質量的主要因素包括保護劑、包埋劑、切片厚度。故采用單因素實驗方法綜合分析，篩選白芷根冰凍切片的最佳制作技術。具體實驗內容見表 1～3。

表1 不同保護劑對白芷根冰凍切片質量的影響

表2 不同包埋劑對白芷根冰凍切片質量的影響

表3 不同切片厚度對白芷根冰凍切片質量的影響

2.2 白芷根中香豆素類成分的自發(fā)熒光實驗[3-4]

香豆素是鄰羥基桂皮酸的內酯，易溶于甲醇、乙醇、氯仿和乙醚；在紫外線照射下易產生藍色熒光，且新鮮材料的熒光性很少變化[5]。

2.2.1 白芷根的熒光顯微鏡觀察 將切好的白芷根材料置于載玻片上，稀甘油制片，置熒光顯微鏡下，用紫外光進行激發(fā)，觀察并照相。

2.2.2 同步陽性對照 取歐前胡素標準品試液于載玻片上，稀甘油制片，置熒光顯微鏡下，用紫外光進行激發(fā)，觀察并照相。

2.2.3 同步陰性對照 將切好的白芷根材料置于載玻片上，滴加70%乙醇配制的FAA固定液，固定大約30 min，依次經過85%、95%、100%乙醇處理后，用稀甘油制成臨時制片后，置熒光顯微鏡下，用紫外光進行激發(fā)，觀察并照相。

2.3 實驗結果

2.3.1 白芷根冰凍切片的制作 通過單因素考察實驗，即在不同條件下進行切片，然后在光學顯微鏡下對各組切片進行觀察、比較并照相，結果顯示，以15%的甘油作為保護劑，OCT為包埋劑，切片厚度為30 μm的白芷根冰凍切片效果最佳。根據(jù)以上結果，結合植物冰凍切片基本操作步驟，得到白芷根冰凍切片的制作技術：取白芷根中部新鮮材料，切成約0.5 cm的小段，立即投入裝有15%甘油保護劑的安瓿瓶中，將其置于玻璃真空干燥器中，使用旋片式真空泵抽氣20 min，使材料空腔完全被保護劑所填充。然后取出，用冰凍切片機進行切片，切片厚度為20～30 μm，用稀甘油制成臨時制片后，立即在熒光顯微鏡下觀察。

2.3.2 白芷根的熒光顯微鏡觀察 白芷根橫切面從外到內結構依次是：木栓層、栓內層、韌皮部、形成層、木質部。在紫外線的激發(fā)下，根的木栓層、木質部及栓內層、韌皮部中的分泌組織處均有強烈的藍色熒光出現(xiàn)（圖1～2）。

圖1 白芷根橫切面（熒光顯微鏡下，示木栓層、韌皮部）

圖2 白芷根橫切面（熒光顯微鏡下，示韌皮部、木質部）

2.3.3 同步陽性對照 在紫外線的激發(fā)下，歐前胡素有強烈的藍色熒光出現(xiàn)（圖3）。

圖3 歐前胡素（熒光顯微鏡下）

圖4 白芷根橫切面（熒光顯微鏡下，經乙醇處理過）

2.3.4 同步陰性對照 經過乙醇處理后的白芷根冰凍切片，在紫外線的激發(fā)下，其木栓層和木質部仍有熒光產生，而分泌組織處的熒光消失（圖4）。

3 討論

本實驗為首次系統(tǒng)開展白芷根冰凍切片制作技術研究，篩選出白芷根冰凍切片的最佳制作技術；首次引入組織化學研究方法，通過科學實驗證實在白芷根中，香豆素類成分僅分布在分泌組織中。該研究為進一步揭示白芷活性成分香豆素類及其積累規(guī)律與白芷內部結構及發(fā)育的關系奠定一定基礎。

本研究僅對白芷根中活性成分之一香豆素類成分進行了組織化學定位研究，有待引入現(xiàn)代先進技術如激光共聚焦顯微鏡技術開展相對定量研究，并可開展白芷藥材另一活性成分揮發(fā)油的組織化學研究，以期為進一步研究中藥白芷活性成分及其積累規(guī)律與其內部結構及發(fā)育的關系奠定扎實的基礎。

[1]鄭艷,徐珞珊,王崢濤.組織化學在藥用植物研究中的應用[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐,2007,22(3):61-63.

[2]謝佩松,徐中根,韋存虛.冰凍切片技術在植物顯微結構和組織化學中的應用[J].生物學雜志,2009,6(3):72.

[3]辛華,丁雨龍.珊瑚菜中香豆素的組織化學定位[J].廣西植物,2008,28(6):847-850.

[4]秦玲,劉文哲.補骨脂中呋喃香豆素類物質的積累規(guī)律及組織定位[J].武漢植物學研究,2007,25(4):360-365.

[5]He JL,Yang KR,Li XG.The Principle of Apparatus Analysis[M].Beijing:Science Press,2002:17-42.