錢衛(wèi)慶，尹 宏，孫海濤

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院（南京市中醫(yī)院）骨傷科，江蘇 南京 210001；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210029

中藥淫羊藿很早即被應(yīng)用于治療抗骨質(zhì)疏松癥的復(fù)方中[1-2]，但其抗骨質(zhì)疏松作用機(jī)制直到近年才引起人們的高度重視，其中淫羊藿對成骨細(xì)胞的作用更是成為此領(lǐng)域的一大研究熱點(diǎn)[3-6]。近年，學(xué)者對淫羊藿苷作用于成骨細(xì)胞的研究較多，但淫羊藿苷對成骨細(xì)胞增殖、分化作用的具體濃度尚存在異議[7-9]，本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠離體成骨細(xì)胞培養(yǎng)體系，檢測不同濃度淫羊藿苷對成骨細(xì)胞增殖和功能的影響，為進(jìn)一步探討淫羊藿苷防治骨質(zhì)疏松的機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 試藥與方法

1.1 藥品及試劑

淫羊藿苷：南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；胰蛋白酶：美國Amresco公司；Ⅱ型膠原酶：南京生興生物技術(shù)有限公司；堿性磷酸酶染液及堿性磷酸酶活性測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 大鼠成骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

將6只出生后24 h內(nèi)的SD大鼠（南京軍參照區(qū)總院動(dòng)物試驗(yàn)中心提供）脫頸處死，取顱骨，具體培養(yǎng)方法見參考文獻(xiàn)[10]。

1.2.2 成骨細(xì)胞鑒定

1.2.2.1 堿性磷酸酶定性染色 （偶氮偶聯(lián)法）原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞生長約85%匯合，0.25%胰酶消化后，接種于鋪有蓋玻片的培養(yǎng)皿。按照堿性磷酸酶染液試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.2.2.2 鈣化結(jié)節(jié)染色 （茜素紅法）原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞生長約85%匯合，0.25%胰酶消化后，接種于培養(yǎng)瓶。染色步驟：在培養(yǎng)瓶中用PBS沖洗2次，95%乙醇固定10 min，三蒸水沖洗 3 次，加入 0.1%茜素紅-Tris-HCl（pH 8.3）37℃，30 min，三蒸水沖洗，干燥，鏡下觀察。

1.2.3 MTT法檢測淫羊藿苷大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響

以每孔5000個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，置于含5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后成骨細(xì)胞貼壁，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別加入濃度為 100.0、40.0、20.0、10.0、1.0、0.1 μg/L的淫羊藿苷和無淫羊藿苷的無血清DMEM培養(yǎng)液，在含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸棄上清液，每孔加入DMSO液 150 μl，振蕩 10 min，使結(jié)晶物溶解，490 nm 波長下測定各孔的光吸收值。

1.2.4 堿性磷酸酶活性檢測

取第2代成骨細(xì)胞，以5×104/ml細(xì)胞濃度接種于24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)至第5天吸去培養(yǎng)液，各孔分別加入含100.0、40.0、20.0、10.0、1.0、0.1 μg/L 和無淫羊藿苷的無血清 DMEM培養(yǎng)液，放入含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集上清液，測定堿性磷酸酶。按照堿性磷酸酶活性測定試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.5對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞的鑒定

第3天時(shí)，細(xì)胞爬片達(dá)85%，爬片細(xì)胞經(jīng)堿性磷酸酶染液后，絕大部分細(xì)胞染色陽性，細(xì)胞核呈紫色，胞膜和胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的紅棕色顆粒（圖1）。培養(yǎng)21 d左右，成骨細(xì)胞密集區(qū)有不透明黑色顆粒（圖2），經(jīng)茜素紅染色后，結(jié)節(jié)區(qū)反應(yīng)陽性，中央染色深，呈深褐色，向周圍逐漸變淺呈橘紅色（圖3）。

圖1 成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色（×100）

圖2 成骨細(xì)胞的礦化節(jié)結(jié)（×100）

圖3 成骨細(xì)胞的礦化節(jié)結(jié)茜素紅染色后（×100）

2.2 淫羊藿苷對成骨細(xì)胞增殖的影響

100.0 、40.0、1.0、0.1 μg/L 濃度組的淫羊藿苷在第 1、3、5天均能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，但與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在第 1、3 天 20、10 μg/L 與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而在第 5天只有 10 μg/L濃度組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 1。

2.3 對細(xì)胞分化的影響

不同濃度淫羊藿苷均能促進(jìn)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的分泌，其中在第1、2天只有20.0、10.0 μg/L兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在第3天只有10 μg/L組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而到了第 5 天各組均無差異（P＞0.05）。 見表 2。

表1 不同濃度淫羊藿苷對成骨細(xì)胞增殖的影響（）

表1 不同濃度淫羊藿苷對成骨細(xì)胞增殖的影響（）

注：與對照組比較，▲P＜0.05

100.0 μg/L 組40.0 μg/L 組20.0 μg/L 組10.0 μg/L 組1.0 μg/L 組0.1 μg/L 組對照組組別 第1天0.307±0.0330.331±0.0340.358±0.037▲0.366±0.034▲0.333±0.0310.333±0.0370.291±0.033第3天0.366±0.0390.371±0.0320.389±0.021▲0.392±0.023▲0.368±0.0320.384±0.0270.351±0.032第5天0.306±0.0250.320±0.0290.321±0.0380.331±0.022▲0.318±0.0250.311±0.0290.299±0.011

表2 不同濃度淫羊藿苷對成骨細(xì)胞分泌堿性磷酸酶的影響（，U/100ml）

表2 不同濃度淫羊藿苷對成骨細(xì)胞分泌堿性磷酸酶的影響（，U/100ml）

注：與對照組比較，▲P＜0.05

100.0 μg/L 組40.0 μg/L 組20.0 μgL 組10.0 μg/L 組1.0 μg/L 組0.1 μg/L 組對照組組別 第1天2.120±0.0732.083±0.0692.175±0.098 ▲2.292±0.132▲2.101±0.1082.095±0.0692.052±0.051第1天2.313±0.0332.326±0.0702.376±0.061▲2.432±0.076▲2.313±0.0532.282±0.0552.270±0.072第3天2.241±0.0612.253±0.592.265±0.0592.309±0.038▲2.228±0.0552.160±0.0652.204±0.045第4天2.136±0.0802.154±0.0922.167±0.0772.173±0.0802.130±0.0692.105±0.0432.099±0.080

3 討論

3.1 淫羊藿在骨質(zhì)疏松癥中的運(yùn)用

淫羊藿作為中藥歷史悠久，現(xiàn)代中藥藥理研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿的主要有效成分是淫羊藿總黃酮和淫羊藿多糖[11]。淫羊藿總黃酮是從小檗科淫羊藿屬植物的莖葉中提取的總黃酮類成分，主要含有淫羊藿苷和淫羊藿次苷等，在許多體外細(xì)胞培養(yǎng)及體內(nèi)試驗(yàn)研究中均發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可以有效促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化、礦化及增強(qiáng)成骨細(xì)胞成骨活性，是一類很有應(yīng)用前景的中藥單體。

3.2 成骨細(xì)胞的發(fā)育

細(xì)胞增殖是成骨細(xì)胞成骨作用的最初階段，其數(shù)量不斷增加，并可形成多層細(xì)胞，因?yàn)槌晒羌?xì)胞能分化合成并分泌大量Ⅰ型膠原蛋白。在成骨細(xì)胞分化過程中，堿性磷酸酶大量表達(dá)，其表達(dá)量的多少，反映出細(xì)胞的分化程度和功能狀態(tài)。當(dāng)成骨細(xì)胞活動(dòng)增強(qiáng)時(shí)，堿性磷酸酶活性升高，反之則降低。堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞分化的早期指標(biāo)。因此，在成骨細(xì)胞骨形成過程，其數(shù)量和功能直接影響骨形成能力，故本研究主要以成骨細(xì)胞的增殖與分化來考量淫羊藿苷對成骨細(xì)胞代謝的影響。

3.3 淫羊藿苷對成骨細(xì)胞發(fā)育的影響

成骨細(xì)胞在接種后24 h增殖迅速，此時(shí)細(xì)胞活力最為旺盛，因此指數(shù)生長階段的細(xì)胞適用于加入樣品，而在培養(yǎng)72 h進(jìn)入平臺(tái)期后，細(xì)胞數(shù)趨于穩(wěn)定，此時(shí)測定可以減少實(shí)驗(yàn)誤差。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示淫羊藿苷可促進(jìn)體外培養(yǎng)大鼠的成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)作用與濃度有關(guān)，到了第5天開始時(shí)作用較弱，一方面可能是由于藥物濃度及藥效減弱，另一方面由于培養(yǎng)液營養(yǎng)的消耗不能維持細(xì)胞生長，培養(yǎng)中也觀察到有較多細(xì)胞漂浮死亡，部分貼壁細(xì)胞形態(tài)皺縮，可能是發(fā)生了凋亡，具體明確的原因還有待于進(jìn)一步的探討。

堿性磷酸酶是參與骨代謝的重要蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是細(xì)胞外基質(zhì)成熟的早期標(biāo)志，堿性磷酸酶的活性可以代表成骨細(xì)胞的早期分化水平[12]。成骨細(xì)胞在接種入培養(yǎng)板的前幾天處于增殖期，堿性磷酸酶分泌低。而細(xì)胞長滿培養(yǎng)板底后，細(xì)胞進(jìn)入成熟期，各項(xiàng)功能性產(chǎn)物包括堿性磷酸酶開始分泌，培養(yǎng)液中堿性磷酸酶濃度較高，因此選用此時(shí)段收集上清液，檢測堿性磷酸酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示淫羊藿苷能促進(jìn)外培養(yǎng)大鼠的成骨細(xì)胞的分化成熟，并有一定的濃度依賴性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平觀察了淫羊藿苷對成骨細(xì)胞代謝調(diào)控的影響，發(fā)現(xiàn)了濃度在10 μg/L時(shí)可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與有些學(xué)者的研究存在差異[1-2]，分析原因，可能由于這方面研究大都基于體外的細(xì)胞培養(yǎng)，組織細(xì)胞的生存環(huán)境在很大程度上有異于體內(nèi)，另外還存在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的差異等，這可能是造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異的原因。下一步實(shí)驗(yàn)除了加強(qiáng)模擬類人體內(nèi)微環(huán)境等新策略，還應(yīng)從蛋白、基因等層次去研究淫羊藿苷具體是通過什么途徑促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的增殖和分化，其深入的研究將為開發(fā)抗骨質(zhì)疏松癥新藥物提供新途徑。

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