李文仕

廣西百色食品藥品檢驗所，廣西 百色 533000

近年來原發(fā)性肝癌發(fā)病率及死亡率呈上升趨勢，研究抗腫瘤藥物成為熱點。癌痛消顆粒是治療原發(fā)性肝癌的純中藥制劑，其處方由白花蛇舌草、半枝蓮、元胡等11味中藥組成。藥效學(xué)研究表明癌痛消顆粒能明顯降低肝癌細(xì)胞DNA含量，促使癌細(xì)胞凋亡[1-2]，明顯改善患者的臨床表現(xiàn)如肝區(qū)疼痛等，顯示出了一定的抗癌療效，有較好的市場前景。半枝蓮是癌痛消顆粒中的君藥成分，為唇形科黃芩屬植物半枝蓮（Scutellaria barbata D.Don）的干燥全草，臨床多用于治療癌癥、肝炎等[3-4]。故可將半枝蓮作為控制癌痛消顆粒質(zhì)量的考查指標(biāo)。半枝蓮中化學(xué)成分主要含有生物堿、糖類及黃酮類化合物[5]，其中野黃芩苷的含量可達(dá)到1%[6-7]。因此擬定將野黃芩苷作為癌痛消的定量指標(biāo)。半枝蓮的含量測定方法主要有紫外分光光度法、比色法、HPLC法、毛細(xì)管電泳法等。而HPLC法是色譜法中應(yīng)用最廣泛的方法，利用高壓泵加壓，使載體流中各種溶質(zhì)快速通過分離管，在短時間內(nèi)完成復(fù)雜的分析工作，其分析特點是快速、準(zhǔn)確、可靠，越來越成為很多藥品含量測定的首選方法[8]。為使藥物達(dá)到安全、有效、可控和穩(wěn)定，實驗探索研究建立癌痛消顆粒的含量測定方法，參照有關(guān)資料[6-10]采用RP-HPLC測定其含量，以保障用藥安全。

1 儀器與試藥

日本島津公司LC-20A高效液相色譜儀，SPD-M10A二極管陣列檢測器，島津LC-Solution色譜工作站；METTLER GR-202電子天平；超聲儀（功率 100 W，頻率 50 Hz），MILLI-PORE純水處理器。野黃芩苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110842-200605）；癌痛消顆粒（廣西中醫(yī)學(xué)院制藥廠提供， 批號：090201、090202、090203）；石油醚 （60～90℃）、磷酸均為分析純；甲醇為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shimadzu Class-VP-ODS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸（34∶66），流速：1.0 ml/min；檢測波長：335 nm；柱溫：室溫；理論塔板數(shù)按野黃芩苷峰計應(yīng)不低于5500。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的野黃芩苷對照品5.45 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。再精密吸取對照品儲備液2.5 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每毫升含野黃芩苷0.0545 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量研細(xì)，取約10 g，精密稱定，置索氏提取器中，加入100 ml石油醚（60～90℃）提取至無色，棄去石油醚液，藥渣揮盡石油醚，加100 ml甲醇繼續(xù)提取至無色，回收甲醇，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按制備工藝，制成缺半枝蓮的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法，制得陰性對照溶液。

2.3 陰性干擾試驗

分別精密吸取對照品溶液、陰性對照溶液與供試品溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，對照品溶液、供試品溶液色譜圖中20.7 min出峰處成分為野黃芩苷，陰性對照溶液在20.7 min時無色譜峰出現(xiàn)，表明處方中其他組分對野黃芩苷的測定沒有干擾。各色譜圖見圖1。

圖1 對照品、供試品、陰性對照溶液HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述對照品儲備液 1、2、3、4、5、6 ml，置10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配成不同濃度的對照品溶液，再分別吸取各溶液10 μl，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測定峰面積。以進(jìn)樣濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程 Y=2.2891×103X+13.3322（r=0.9995）。結(jié)果表明，野黃芩苷進(jìn)樣濃度在21.8～130.8 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

在上述色譜條件下，精密吸取同一野黃芩苷對照品溶液10 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果6次測得野黃芩苷峰面積的RSD為0.88%，表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

取同一批號（批號：090201）的樣品細(xì)粉6份，按照“2.2.2”項下樣品制備方法制備并進(jìn)樣測定，每次進(jìn)樣10 μl，測定野黃芩苷平均含量。結(jié)果6份含量的RSD為1.34%，表明重復(fù)性較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一批供試品溶液（批號：090201），分別于 0、1、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣測定其中野黃芩苷的峰面積，結(jié)果RSD為1.67%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取約5 g已知含量的供試品（批號：090201，含量0.0851 mg/g）6份，分別精密加入野黃芩苷對照品適量，按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，進(jìn)行含量測定并計算回收率。見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.9 樣品含量測定

取上述癌痛消顆粒 3批 （批號：090201、090202、090203），按“2.2”項下方法制備供試品溶液和對照品溶液，分別進(jìn)樣10 μl測定峰面積，按外標(biāo)法計算含量，結(jié)果3批癌痛消顆粒中野黃芩苷的含量分別為0.0851、0.0874、0.0860 mg/g，RSD為1.72%。

3 討論

3.1 提取溶劑選擇

野黃芩苷（分子式：C21H18O12，分子量：462.37）為黃色針狀結(jié)晶（在乙醇中），溶于堿和冰醋酸、吡啶，微溶于一般的有機溶媒，不溶于水。根據(jù)野黃芩苷的性質(zhì)，選擇甲醇作為提取溶劑。用甲醇將癌痛消顆粒溶解后發(fā)現(xiàn)溶液顏色很深，其中含有的雜質(zhì)、色素較多，會對其含量測定有干擾，且易污染色譜儀。改為先用石油醚（60～90℃）除雜質(zhì)，再用甲醇提取的方法，可除去油脂、蠟、葉綠素、揮發(fā)油、三萜類及游離甾體等化合物。

3.2 提取方法篩選

比較用甲醇超聲提取和用甲醇索氏提取時的效果。稱取同一樣品兩份，一份用100 ml甲醇進(jìn)行索氏提取至無色，另一份用100 ml甲醇超聲提取1 h，測定野黃芩苷含量。結(jié)果表明用索氏提取方法測得的野黃芩苷含量較高，因此擬定癌痛消顆粒用石油醚（60～90℃）除雜質(zhì)后，加甲醇用索氏提取器回流提取，再濃縮定容。實驗結(jié)果表明該法提取充分，測定的結(jié)果準(zhǔn)確，故采用此法。

3.3 流動相的選擇

因為野黃芩苷分子結(jié)構(gòu)中羥基易電離而使色譜峰擴散，故應(yīng)在流動相中加入少量酸抑制其色譜峰拖尾。曾采用甲醇-0.1%磷酸、甲醇-3%醋酸進(jìn)行試驗，前者的基線較平穩(wěn)，峰型較好。以甲醇-0.1%磷酸（40∶60）作流動相時，野黃芩苷的保留時間為12.6 min，但在14.1 min時有雜質(zhì)峰干擾其測定，調(diào)整流動相的比例為34∶66時兩峰分開，野黃芩苷的保留時間為20.7 min，且峰型也較好，故用甲醇-0.1%磷酸（34∶66）作為流動相。

結(jié)果顯示，本試驗建立的癌痛消顆粒中野黃芩苷含量的測定方法，專屬性較強，重復(fù)性較好，精密度較高，結(jié)果較為可靠，可作為該制劑質(zhì)量控制方法。

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