齊 霽 ，鄒小龍

1.北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100029；2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一臨床醫(yī)院普外科，黑龍江 哈爾濱 150081

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是多因素、多基因相互作用的結(jié)果。傳統(tǒng)基因治療技術(shù)一般是在基因水平特異性地誘導單個癌基因失活，即基因治療只通過對某一個癌基因進行抑制從而起到治療作用，但是對于多基因致病的腫瘤來說，僅對其中某個基因?qū)崿F(xiàn)基因沉默很難達到預(yù)期的療效。與此同時，基因治療是指在轉(zhuǎn)錄水平誘導基因發(fā)生沉默，這種治療的生物安全性較差。而技術(shù)日趨成熟的RNA干擾（RNAi）技術(shù)的不斷發(fā)展和完善為解決傳統(tǒng)基因治療的生物安全性問題提供了一種可能。RNAi是一種基因轉(zhuǎn)錄后沉默技術(shù)，這種技術(shù)不僅可以產(chǎn)生類似于基因敲除的效果，又不會對目標DNA序列產(chǎn)生任何遺傳上的改變。由于RNA干擾序列具有很強的序列特異性，因此在RNA干擾序列設(shè)計的過程中可以利用同一基因家族中的多個基因具有同源性很高的一段保守序列這一特性，設(shè)計出針對某些序列的特異siRNA分子。而后通過注射設(shè)計好的siRNA使同源基因產(chǎn)生基因沉默效應(yīng)，同時，與傳統(tǒng)的基因治療相比，這種RNAi對機體其他的基因產(chǎn)生不良影響較少[1]。RNAi技術(shù)具有較高的穩(wěn)定性和基因沉默的效率，而且將siRNA進一步地加以修飾就可以有效地避免核酸酶的降解，使其更穩(wěn)定地發(fā)揮作用，從而實現(xiàn)對90%以上的基因進行沉默。綜上所述，RNAi技術(shù)在腫瘤的病因研究和靶向治療等方面具有明顯的優(yōu)勢。因此，充分發(fā)揮RNAi技術(shù)的優(yōu)勢對于腫瘤研究和治療有著舉足輕重的作用。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，Del1和VEGF分屬于不同類別的促血管形成因子，這兩類因子在結(jié)腸癌的腫瘤血管生成方面具有協(xié)同的促進作用[2]。本實驗使用RNAi抑制促血管形成因子基因的表達，觀察結(jié)腸癌的基因治療效果，從而明確RNAi抑制促血管形成因子的基因治療方式對結(jié)腸癌治療效果的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

5周齡BALB/C裸鼠（nu/nu）60只，購于上海伊萊克斯實驗動物有限責任公司。Del1和VEGF基因shRNA表達質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒由武漢晶賽公司構(gòu)建合成。

1.2 ShRNA表達質(zhì)粒的構(gòu)建

Del1和VEGF基因shRNA表達質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒由武漢晶賽公司構(gòu)建合成。四條針對Del1基因（Genbank HSU7_0312）不同靶點的shRNA篩選設(shè)計后構(gòu)建于同一個質(zhì)粒中，四條shRNA的序列為：AATGGAGGTATCTGTTTGC CA（207～227nt）；GTTCAGTGTTGTGGAGGT（286～304nt）;AAGC ATACCGG-GGGATACAT （388～408 nt)；AATGTCATCGACCTCCCATC（1443～1463 nt）。 合成的重組質(zhì)粒記為pshRNADel1。三條針對VEGF基因（GenBankNM_001033756）不同靶點的shRNA篩選設(shè)計后構(gòu)建于同一個質(zhì)粒中，三條shRNA的 序 列 為 AGAAAGATAGAGCAAGACA （1429～1447 nt）；CGCAGAAGTGCTAGCTCG（728～746 nt）；CCTTGCCTGCTGCT CTAC （1064～1082 nt）。合成的重組質(zhì)粒記為 pshRNAVEGF。經(jīng)過BLASTN檢驗與其他基因沒有同源性。晶賽公司將4種不同哺乳動物的啟動子 （hU6、hH1、mU6和h7SK）分別操縱的shRNA轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)單元，即啟動子－shRNA正義鏈－loop環(huán)－shRNA反義鏈－終止信號構(gòu)建到一個RNAi載體中，從而實現(xiàn)了一個載體編碼4條shRNA的目的。不同的啟動子轉(zhuǎn)錄其相應(yīng)的shRNA結(jié)構(gòu)單元，其結(jié)果不僅可以有效地避免意外重組的發(fā)生，而且可以使每條shRNA都能夠有效地完成轉(zhuǎn)錄。

1.3 腫瘤細胞懸液的制備

待腫瘤細胞培養(yǎng)至60%～70%融合時，棄去腫瘤細胞培養(yǎng)液，PBS沖洗2遍后，培養(yǎng)瓶中加入胰酶消化90 s，其后加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，實現(xiàn)終止消化并用吸管將貼于瓶壁的細胞吹打下來，而后將混合物一起放置于50 ml的離心管中，將離心機轉(zhuǎn)速調(diào)至1000 r/min，離心5 min后，棄上清液，加入20 ml PBS重懸均勻后進行細胞計數(shù)，同時調(diào)整細胞濃度為5×107個/ml，最后吸入1 ml注射器中備用。

1.4 裸鼠的腫瘤接種

將適應(yīng)SPF環(huán)境的5周齡裸鼠建立結(jié)腸癌動物模型。首先在將裸鼠的籠子進行消毒處理。固定裸鼠，取其側(cè)腹部為穿刺點，穿刺前用碘伏對穿刺點進行消毒，注射器針頭皮下潛行1 cm左右深進行穿刺，緩慢向該部位推注腫瘤細胞懸液0.1 ml/只。推注完成退針后，再次進行消毒。

1.5 裸鼠的分組

接種后觀察裸鼠成瘤情況。并在成瘤后用游標卡尺測量腫瘤體積：腫瘤體積 V=π/6×a2×b，π=3.14[注：長徑（b）、短徑（a）]。待裸鼠接種腫瘤生長至體積約為100 mm3時，將60只接種腫瘤的裸鼠隨機分為5組，分別為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組（Untreated組）、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對照組（Control組）、轉(zhuǎn)染 pshRNADel1質(zhì)粒組（pshRNA-Del1治療組），轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組 （pshRNA-VEGF治療組）和轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒組 （pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF治療組）。進行基因治療4 d，5組成瘤裸鼠各組隨機抽4只，檢驗其腫瘤中的基因表達情況。其余的裸鼠治療3周后，將裸鼠處死并進行后續(xù)的研究。

1.6 腫瘤的治療及觀察指標

1.6.1 腫瘤治療 基因轉(zhuǎn)染液的配制：將濃度為2 mg/ml的純化真核表達質(zhì)粒 100 μl，用 100 μl FuGENE6稀釋待用。將目的基因 重組 質(zhì) 粒 pshRNA-Del1，pshRNA-VEGF，pshRNADel1+pshRNA-VEGF在FuGENETM6的介導下轉(zhuǎn)染至細胞中，其使用的劑量為每只裸鼠每次200 μg質(zhì)粒與100 μl FuGENETM6混合，直接對裸鼠瘤體內(nèi)多點行混合注射。Control組裸鼠處理方式是在腫瘤內(nèi)注射200 μg的pshRNAGFP質(zhì)粒；pshRNA-Del1治療組裸鼠的處理方式是在腫瘤內(nèi)注射200 μg的pshRNA-Del1質(zhì)粒；pshRNA-VEGF治療組裸鼠的處理方式是在腫瘤內(nèi)注射200 μg的pshRNA-VEGF質(zhì)粒；pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF治療組裸鼠的處理方式是在腫瘤內(nèi)先注射100 μg的pshRNA-Del1質(zhì)粒，間隔12 h以后，再在腫瘤內(nèi)注射100 μg的pshRNA-VEGF質(zhì)粒。

1.6.2 觀察指標 ①腫瘤生長曲線：在腫瘤內(nèi)注射藥物后，每天觀察腫瘤的生長情況，并且于注射藥物后的第0、3、6、9、12、15、18、21天分別用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑的大小并記錄，而后計算腫瘤的體積大小。測量后將各組裸鼠腫瘤的體積取平均值，繪制皮下腫瘤的生長曲線圖。②蛋白質(zhì)印跡（Western-blot）：在進行了質(zhì)粒注射4 d后，切取腫瘤標本，進行低溫保存。部分腫瘤組織采用蛋白印跡的方法對各組Del1蛋白和VEGF蛋白的表達情況進行測定，測定中將分組中的未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對照組（untreated組）視為蛋白定量檢測的對照組。③免疫組織化學檢測分析：采用免疫組織化學兩步法，組織切片常規(guī)脫蠟，3%過氧化氫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。根據(jù)所應(yīng)用的一抗的要求，對組織切片進行預(yù)處理（抗原修復）。滴加小鼠來源的一抗（Ki-67，CD31、VEGF 和 Del1抗體），室溫孵育 60 min，PBS或 TBS沖洗，2 min×3次。滴加兔抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體，室溫孵育20 min，PBS或TBS沖洗，2 min×3次。應(yīng)用DAB溶液染色。蒸餾水沖洗10 min、蘇木精復染、脫水、中性樹脂封片。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理。免疫組織化學的統(tǒng)計分析采用χ2檢驗。其他實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，采用方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤生長曲線

在腫瘤模型建立后，當腫瘤的體積達到100 mm3時，隨機將其分為以下5組：未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組（Untreated組），轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對照組（Control組）、轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組（pshRNADel1治療組），轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組（pshRNA-VEGF治療組）和轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒組（pshRNADel1+pshRNA-VEGF治療組）。如圖1所示：在相同時間點，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對照組比較，腫瘤的體積未見明顯差異（P＞0.05）；而轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組分別于與對照組相比較發(fā)現(xiàn)，其腫瘤的平均體積明顯減小，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步的分析顯示，轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組的腫瘤平均體積與轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組的腫瘤平均體積間無明顯的差異（P＞0.05）。與其他各組相比，筆者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒組的腫瘤平均體積最小，該治療組與對照組的腫瘤體積比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒組分別與轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組以及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對照組腫瘤體積比較，差異均有統(tǒng)計學意義 （均P＜0.05）。

圖1 腫瘤生長曲線圖

圖2 West-blot檢測蛋白表達變化圖

2.2 腫瘤基因治療后各治療組Del1蛋白和VEGF蛋白的表達

對腫瘤行基因治療4 d后，從各治療組均隨機選取4只裸鼠處死，并切除其腫瘤組織待后續(xù)研究。選取轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組作為后續(xù)分析的對照組。取切除腫瘤部分組織制備組織勻漿，并提取其蛋白，利用West-blot方法檢測Dell基因和VEGF基因的蛋白表達量，從而進一步分析基因治療前后，各組內(nèi)這2種蛋白的表達變化。如圖2和圖3所示：與對照組相比，Del1蛋白的表達量在轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組明顯呈下降的狀態(tài)，并且Del1蛋白的表達量在組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與此同時，筆者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒組Del1蛋白的表達量下降最為明顯，與對照組相比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。但轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組相比較，Del1蛋白的表達量未見明顯的差異 （P＞0.05），但這兩組分別與轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒組比較，差異均有統(tǒng)計學意義 （均P＜0.05）。對于VEDF蛋白的表達來說，轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組與對照組中VEGF蛋白的表達量比較，其明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），同時筆者發(fā)現(xiàn)Del1蛋白的表達量也呈現(xiàn)明顯下降的狀態(tài)。轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNAVEGF質(zhì)粒組和對照組相比，其VEGF蛋白的表達量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。但是轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒治療組與轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒治療相比，VEGF蛋白的表達量無變化（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染 pshRNADel1質(zhì)粒組與對照組相比，VEGF蛋白的表達量無變化 （P＞0.05），但Del1蛋白的表達量明顯地下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 蛋白表達變化圖

2.3 腫瘤細胞的Ki-67免疫組化染色結(jié)果

對于腫瘤組織進行RNAi治療4 d后，每組隨機選取4只裸鼠處死。將每個切取的腫瘤組織先用多聚甲醛固定，而后用石蠟包埋，然后進行連續(xù)切片，切片厚度4 μm。完成上述處理后，用抗Ki-67的抗體進行免疫組化染色，標記腫瘤組織中增殖的腫瘤細胞。將轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組作為對照組，定性的染色結(jié)果如圖4所示：細胞核染為棕色的為Ki-67染色陽性腫瘤細胞。筆者發(fā)現(xiàn)與對照組相比，轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒組的腫瘤細胞呈現(xiàn)減少的趨勢。從定量的角度研究腫瘤細胞增殖的變化是否顯著，其結(jié)果如圖5所示。從圖5的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，轉(zhuǎn)染pshRNA-Dell質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組中的腫瘤細胞增殖百分比明顯降低，并且與對照組相比，其腫瘤增殖率差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。從圖5中筆者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒組腫瘤細胞的增殖是最低的，并且這組與對照組相比較，其差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖4 染色腫瘤細胞增殖變化圖

圖5 腫瘤增殖率變化圖

2.4 腫瘤的微血管密度

對腫瘤組織進行RNAi治療3周后，將各組的裸鼠處死，測量其腫瘤的各個徑線后，用4%的多聚甲醛固定，而后用石蠟包埋并連續(xù)切片，切片厚4 μm。采用抗-CD31單克隆抗體行二步法免疫組化染色檢驗?zāi)[瘤的微血管密度變化，其中棕色染色為陽性，在腫瘤組織切片中，隨機地選取不同的位置來記錄微血管的密度變化。將轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組作為對照組，如圖6所示：與對照組相比，轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNAVEGF質(zhì)粒組的腫瘤微血管密度呈現(xiàn)減少的趨勢。從定量的角度而言，如圖7顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組中其腫瘤的微血管密度減少量約為40%，該組與對照組腫瘤的微血管密度比較，差異有高度統(tǒng)計學意義 （P＜0.01）。轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組的腫瘤微血管密度也較對照組減少了24%，這兩組腫瘤的微血管密度比較，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。此外，與對照組相比，轉(zhuǎn)染pshRNADel1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒組較對照組的腫瘤微血管密度減少了60%，并且這兩組間腫瘤微血管密度比較，差異有高度統(tǒng)計學意義 （P＜0.01）。與此同時，筆者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pshRNADel1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒組的腫瘤微血管密度分別與轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組相比，均呈現(xiàn)下降的狀態(tài)，并且腫瘤微血管密度在組間的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染 pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF 質(zhì)粒組腫瘤的微血管密度減少最明顯，也說明了pshRNA-Del1質(zhì)粒和pshRNA-VEGF質(zhì)粒在抑制腫瘤微血管生成方面具有較強的協(xié)同作用。

圖6 腫瘤新生血管切片染色圖

圖7 腫瘤新生血管的密度變化圖

3 討論

惡性腫瘤的發(fā)生是多個癌基因共同作用的結(jié)果，是多因子、多水平的異常引起的惡性疾病?，F(xiàn)階段對于癌癥的臨床治療治療，控制血管再生過程是控制惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要手段。血管再生是有多種細胞分泌的多種細胞因子參與的、在預(yù)存的血管上產(chǎn)生新的毛細胞血管的過程[3]。眾所周知，腫瘤細胞的促血管生成過程與很多細胞因子有關(guān)，如生長因子，腫瘤壞死因子-α、趨化因子、P53和成纖維生長因子2等，但在本研究中，筆者選擇了在腫瘤組織和正常組織呈現(xiàn)顯著差異表達的促血管再生因子VEGF和內(nèi)皮細胞生長調(diào)節(jié)蛋白Del1[4-5]。腫瘤中酸性、低氧的腫瘤微環(huán)境，可以誘導VEGF的大量表達[6]。VEGF可以通過旁分泌促進局部微血管的新生，從而為腫瘤細胞提供了營養(yǎng)補給，促進了腫瘤細胞的生長，起到了促血管生成的作用。與此同時，VEGF也可以通過自分泌起到血管透性因子的作用，從而影響腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡的細胞行為，以及干擾宿主抗原提成和加工等免疫過程，從而促進了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[7]。此外，在腫瘤細胞中，VEGF蛋白與KDR基因發(fā)生互作以后，共同激活MAPK級聯(lián)通路，從而增加了HSP90蛋白的表達從而誘導了BCL2基因的過表達，最終抑制了細胞的凋亡過程[8]。因此，可以通過用RNAi技術(shù)來實現(xiàn)對VEGF基因的沉默，從而使得細胞的凋亡過程不受抑制，從而可以實現(xiàn)對結(jié)腸癌腫瘤細胞增殖的抑制。對于DEL1基因的作用，Chiaki Hidai等[9]首次在1997年的小鼠胚胎研究中進行了報道報道，DEL1基因在受精后9 d的胚胎中表達量呈現(xiàn)上調(diào)，而后微血管的密度逐漸加大，隨著血管網(wǎng)絡(luò)的日趨成熟，DEL1的表達量又開始逐漸下降，直到出生后Del1的表達量不呈現(xiàn)差異表達。這也就說明與血管生成調(diào)節(jié)因子（flk1）和血小板內(nèi)皮細胞黏附因子（CD31）的作用類似，DEL1在胚胎發(fā)育的不同階段呈現(xiàn)特定的表達模式[10]。這些內(nèi)皮細胞的變化的標志物，提示Del1對于血管細胞的生成和內(nèi)皮細胞的變化具有很重要的調(diào)節(jié)作用。本研究利用轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染pshRNAVEGF質(zhì)粒和同時轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒對裸鼠的移植腫瘤進行RNAi治療，結(jié)果顯示無論是抑制Del1還是抑制VEGF蛋白的翻譯都可以抑制腫瘤細胞的生長和增殖。但是對比這兩組之間的腫瘤生長情況，未見差異。該結(jié)果顯示Del1和VEGF都可以作為抑制結(jié)腸癌腫瘤細胞生長的藥物靶點。進一步來說，本研究中也發(fā)現(xiàn)協(xié)同的抑制Del1和VEGF兩個蛋白對于腫瘤細胞的生長和增殖，以及腫瘤細胞的微血管密度都有更好的抑制作用，因此，在今后的研究中可以考慮同時抑制Del1和VEGF兩個蛋白，以期望取得更好的治療效果。

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