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        分子標(biāo)記在甜菜離子注入誘變育種中的初步應(yīng)用

        2011-07-26 13:52:38高文偉曲延英于月華李玉嬌王燕飛
        中國(guó)糖料 2011年2期
        關(guān)鍵詞:離子注入甜菜突變體

        高文偉 ,馬 林,沙 紅,曲延英,于月華,劉 珊 ,李玉嬌,王燕飛

        (1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所,烏魯木齊 830091)

        分子標(biāo)記輔助育種是利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的DNA來(lái)對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行間接性選擇,早代就能夠?qū)δ繕?biāo)基因的轉(zhuǎn)移進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定的選擇,而且克服隱性基因再度利用識(shí)別的困難,從而加速育種進(jìn)程,提高育種效率,選育抗病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的品種[1-13]。我國(guó)的農(nóng)作物分子標(biāo)記輔助育種的研究始于90年代初,在過(guò)去的近十年時(shí)間里,取得了重要的研究進(jìn)展:(1)構(gòu)建了水稻等作物的染色體遺傳圖譜;(2)構(gòu)建了水稻染色體物理圖譜;(3)利用分子標(biāo)記對(duì)我國(guó)作物種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行了初步研究;(4)對(duì)一些重要的農(nóng)藝性狀進(jìn)行了定位、作圖與標(biāo)記,相應(yīng)的基因克隆已在進(jìn)行[8]。就甜菜而言,在國(guó)外RFLP、RAPD、SSR和AFLP分子標(biāo)記已先后用于遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性檢測(cè)、品種(系)鑒別及重要農(nóng)藝性狀的分子標(biāo)記等方面的研究。然而開展甜菜高糖性、早熟性分子標(biāo)記在國(guó)內(nèi)還未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)報(bào)道,尤其是本次利用離子注入誘變產(chǎn)生的高糖、早熟突變體做親本進(jìn)行分子標(biāo)記研究尚屬首次。

        本實(shí)驗(yàn)以離子注入誘變獲得的高糖突變體、早熟突變體和未經(jīng)誘變處理的對(duì)照為材料,構(gòu)建RAPD分子標(biāo)記相關(guān)指紋圖譜,為定位高糖、早熟性狀相關(guān)的基因或QTL和利用甜菜的高糖性、早熟性指導(dǎo)育種實(shí)踐,加快育種進(jìn)程奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        甜菜優(yōu)良親本材料7208、離子注入誘變高糖體S10、早熟體W11。

        1.2 方法

        1.2.1 改良的SDS法 取甜菜葉片0.2g,同時(shí)把SDS提取液在65℃下預(yù)熱,然后進(jìn)行甜菜葉片的研磨。在研樣中加500μL SDS提取液,之后裝入離心管中并在65℃水浴鍋下加熱30min,在加熱過(guò)程中,輕搖2~3次。取出,冷卻后加氯仿異戊醇500μL輕搖至勻,離心(12000r/min,15min)。取上清液,加氯仿異戊醇離心(8000r/min,10 min)。再取上清液,用無(wú)水乙醇沉淀靜置、離心(8000r/min,6min)。最后用70%乙醇洗2次,晾干,超純無(wú)菌水溶解放置(4℃)冰箱中備用。

        1.2.2 PCR反應(yīng) ⑴RAPD反應(yīng)體系中的試劑及用量:Buffer 2.5μL,10M dNTPs 0.5μL,超純無(wú)菌水 14.1μL,Taq 酶 0.4μL,Mg2+2.5μL, 模板 DNA 4μL, 引物 1μL。 ⑵PCR 擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性 5min,94℃變性 1min,37℃復(fù)性 1min,72℃延伸 2min循環(huán) 44次,72℃再延伸 5min,4℃保存。

        1.2.3 電泳及染色 采用瓊脂糖凝膠電泳,電壓100V,時(shí)間25 min。最后在Bio-Rad自動(dòng)凝膠成像儀上觀察PCR結(jié)果。

        1.2.4 帶型分析 以0、1為標(biāo)記,建立EXCEL分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù),0代表無(wú)條帶,1代表有條帶。

        2 結(jié)果與分析

        大量田間試驗(yàn)表明:通過(guò)離子注入后所獲得的早熟性狀和含糖率高的性狀是穩(wěn)定遺傳的。因此本研究對(duì)其進(jìn)行分子檢測(cè),以期獲得與這些性狀緊密連鎖的標(biāo)記,并利用分子標(biāo)記來(lái)進(jìn)行輔助選擇育種或研究種質(zhì)資源。

        2.1 DNA的瓊脂糖電泳檢測(cè)

        在已有工作基礎(chǔ)上總結(jié)出一種簡(jiǎn)單,成本低廉,提取DNA效果又好的SDS方法。采用此方法提取效率較高,主帶明亮,整齊一致,降解現(xiàn)象不明顯。

        2.2 RAPD體系的建立

        甜菜優(yōu)良親本7208、離子注入高糖突變體S10和早熟突變體W11為材料,以離子注入誘變?cè)缡祗w的RAPD分子標(biāo)記篩選為技術(shù)基礎(chǔ)[8],根據(jù)其他作物的標(biāo)記體系進(jìn)行整合后,建立了適于甜菜的RAPD分子標(biāo)記體系。

        圖1 DNA檢測(cè)

        圖2 RAPD檢測(cè)

        此圖證實(shí)了用改良的SDS法提取DNA可以應(yīng)用到RAPD-PCR的擴(kuò)增體系。在C1、T20、AE20、U15、C2、C11引物下離子注入誘變體與非離子注入誘變體的DNA條帶有差異,同時(shí)兩個(gè)離子注入誘變體S10、W11之間也存在差異。

        2.2.1 多態(tài)性引物的確定 以 7208、S10、W11為材料,采用實(shí)驗(yàn)室建立起來(lái)的RAPD分子標(biāo)記技術(shù)體系,從800條RAPD引物中篩選出擴(kuò)增帶型有差異且?guī)颓逦€(wěn)定的引物。

        表1 鑒定材料間差異的DNA多態(tài)性引物

        從表1中看出有18個(gè)引物可以鑒別S10、7208之間的差異,也有18個(gè)引物可以鑒別W11、7208之間的差異。它們之間的引物并不是完全不同,V3、W5、C2、U15、AE20是它們共有的,占總引物的0.625%。有5個(gè)引物可以鑒別S10、W11之間的差異,占總引物的0.625%。由此可以證明雖然離子注入產(chǎn)生了高糖和早熟兩個(gè)變異體,但是它們之間的差異比較小,這主要是因?yàn)樗鼈兇蟛糠诌z傳物質(zhì)和親本7208相似。

        2.2.2 帶型統(tǒng)計(jì)分析 以0、1為標(biāo)記,建立EXCEL分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù),0代表無(wú)條帶,1代表有條帶。

        通過(guò) 7208、S10、W11的 RAPD 引物的篩選和特異性引物對(duì)應(yīng)的DNA指紋(見表2、3、4)統(tǒng)計(jì),可以建立相應(yīng)的RAPD分子標(biāo)記指紋圖譜庫(kù),同時(shí)也可以看出:用一個(gè)引物很難確定是哪種變異,因此確定某一種變異應(yīng)用多個(gè)引物的組合或指紋組合。

        表2 引物所對(duì)應(yīng)的S10、7208的DNA指紋

        表3 引物所對(duì)應(yīng)的W11、7208的DNA指紋

        表4 引物所對(duì)應(yīng)的S10、W11的DNA指紋

        3 討論

        甜菜是兩年生作物,通過(guò)常規(guī)雜交轉(zhuǎn)育產(chǎn)生新的基因源,一則周期太長(zhǎng),二則在沒有基因來(lái)源的情況下,很難獲得新的創(chuàng)新材料。在甜菜理化誘變中,曾先后應(yīng)用航天、鈷60等誘變方法,但效果均不明顯。離子注入技術(shù)具有定向性、多樣性及安全性,有較高的突變譜。新疆在甜菜上利用離子注入技術(shù)獲得了創(chuàng)新早熟親本材料一份W11,含糖率增加的高糖親本一份S10,而且此種變異可以穩(wěn)定遺傳[8]。

        隨機(jī)引物多態(tài)性DNA片斷可作為分子標(biāo)記。這種方法即為RAPD。盡管RAPD技術(shù)誕生的時(shí)間很短,但由于其獨(dú)特的檢測(cè)DNA多態(tài)性的方式具有快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn),使這個(gè)技術(shù)已滲透于基因組研究的各個(gè)方面。該RAPD技術(shù)建立于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上,它是利用一系列不同的隨機(jī)排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈為引物,對(duì)所研究基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[13]。聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離,經(jīng)EB染色或放射性自顯影來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片斷的多態(tài)性,這些擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片斷的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但對(duì)于任一特異的引物,它同基因組DNA序列有其特異的結(jié)合位點(diǎn)。這些特異的結(jié)合位點(diǎn)在基因組某些區(qū)域內(nèi)的分布如符合PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件,即引物在模板的兩條鏈上有互補(bǔ)位置,且引物3’端相距在一定的長(zhǎng)度范圍內(nèi),就可以擴(kuò)增出DNA片斷。因此如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA片斷插入、缺失或堿基突變就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點(diǎn)分布發(fā)生相應(yīng)的變化,而使PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量的改變。通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物檢測(cè)即可檢出基因組DNA的多態(tài)性。分析時(shí)可用的引物數(shù)量很大,雖然對(duì)每一個(gè)引物而言其檢測(cè)基因組DNA多態(tài)性的區(qū)域是有限的,但是利用一系列引物則可以使檢測(cè)區(qū)域幾乎覆蓋整個(gè)基因組。因此RAPD可以對(duì)整個(gè)基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)。另外,RAPD片斷克隆后可作為RFLP的分子標(biāo)記進(jìn)行作圖分析。

        由本實(shí)驗(yàn)可知:利用RAPD檢測(cè)可以區(qū)分7208、W11、S10三者的差異并且通過(guò)分析也驗(yàn)證了突變的低頻性。利用RAPD檢測(cè)可以區(qū)分7208、W11、S10三者的差異,正好和大田上三者之間存在有差異的結(jié)果是一致的,表明三者之間可能存在遺傳物質(zhì)上的差異。同時(shí)RAPD檢測(cè)可以較早地對(duì)甜菜的種子進(jìn)行室內(nèi)檢測(cè),從而更早地對(duì)誘變體進(jìn)行選擇。但是用RAPD進(jìn)行分子標(biāo)記,存在重復(fù)性差等局限性,因此為了彌補(bǔ)RAPD和大田檢測(cè)的局限性,還需要轉(zhuǎn)換一種SCAR的特異性的分子標(biāo)記技術(shù)來(lái),更加準(zhǔn)確地鑒定出離子注入誘變產(chǎn)生的變異。

        4 結(jié)論

        本文通過(guò)RAPD分析得到了7208、W11、S10之間有差異的引物;通過(guò)帶型分析建立了7208、W11和S10的指紋圖譜庫(kù)。由實(shí)驗(yàn)可知:利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)了甜菜突變體,檢測(cè)差異的大小和大田檢測(cè)進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果是基本一致的,從而也證明了RAPD分子標(biāo)記技術(shù)是可以用于檢測(cè)生物的突變體的,因此用RAPD分子標(biāo)記對(duì)7208、W11、S10之間的差異進(jìn)行監(jiān)測(cè),在早代進(jìn)行選擇,可以指導(dǎo)大田育種。再通過(guò)大田育種的結(jié)果來(lái)驗(yàn)證分子育種的可行性,以確認(rèn)標(biāo)記的準(zhǔn)確性。

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