亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        分子標(biāo)記在甜菜離子注入誘變育種中的初步應(yīng)用

        2011-07-26 13:52:38高文偉曲延英于月華李玉嬌王燕飛
        中國糖料 2011年2期
        關(guān)鍵詞:離子注入甜菜突變體

        高文偉 ,馬 林,沙 紅,曲延英,于月華,劉 珊 ,李玉嬌,王燕飛

        (1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所,烏魯木齊 830091)

        分子標(biāo)記輔助育種是利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的DNA來對目標(biāo)性狀進(jìn)行間接性選擇,早代就能夠?qū)δ繕?biāo)基因的轉(zhuǎn)移進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定的選擇,而且克服隱性基因再度利用識別的困難,從而加速育種進(jìn)程,提高育種效率,選育抗病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的品種[1-13]。我國的農(nóng)作物分子標(biāo)記輔助育種的研究始于90年代初,在過去的近十年時間里,取得了重要的研究進(jìn)展:(1)構(gòu)建了水稻等作物的染色體遺傳圖譜;(2)構(gòu)建了水稻染色體物理圖譜;(3)利用分子標(biāo)記對我國作物種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行了初步研究;(4)對一些重要的農(nóng)藝性狀進(jìn)行了定位、作圖與標(biāo)記,相應(yīng)的基因克隆已在進(jìn)行[8]。就甜菜而言,在國外RFLP、RAPD、SSR和AFLP分子標(biāo)記已先后用于遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性檢測、品種(系)鑒別及重要農(nóng)藝性狀的分子標(biāo)記等方面的研究。然而開展甜菜高糖性、早熟性分子標(biāo)記在國內(nèi)還未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)報(bào)道,尤其是本次利用離子注入誘變產(chǎn)生的高糖、早熟突變體做親本進(jìn)行分子標(biāo)記研究尚屬首次。

        本實(shí)驗(yàn)以離子注入誘變獲得的高糖突變體、早熟突變體和未經(jīng)誘變處理的對照為材料,構(gòu)建RAPD分子標(biāo)記相關(guān)指紋圖譜,為定位高糖、早熟性狀相關(guān)的基因或QTL和利用甜菜的高糖性、早熟性指導(dǎo)育種實(shí)踐,加快育種進(jìn)程奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        甜菜優(yōu)良親本材料7208、離子注入誘變高糖體S10、早熟體W11。

        1.2 方法

        1.2.1 改良的SDS法 取甜菜葉片0.2g,同時把SDS提取液在65℃下預(yù)熱,然后進(jìn)行甜菜葉片的研磨。在研樣中加500μL SDS提取液,之后裝入離心管中并在65℃水浴鍋下加熱30min,在加熱過程中,輕搖2~3次。取出,冷卻后加氯仿異戊醇500μL輕搖至勻,離心(12000r/min,15min)。取上清液,加氯仿異戊醇離心(8000r/min,10 min)。再取上清液,用無水乙醇沉淀靜置、離心(8000r/min,6min)。最后用70%乙醇洗2次,晾干,超純無菌水溶解放置(4℃)冰箱中備用。

        1.2.2 PCR反應(yīng) ⑴RAPD反應(yīng)體系中的試劑及用量:Buffer 2.5μL,10M dNTPs 0.5μL,超純無菌水 14.1μL,Taq 酶 0.4μL,Mg2+2.5μL, 模板 DNA 4μL, 引物 1μL。 ⑵PCR 擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性 5min,94℃變性 1min,37℃復(fù)性 1min,72℃延伸 2min循環(huán) 44次,72℃再延伸 5min,4℃保存。

        1.2.3 電泳及染色 采用瓊脂糖凝膠電泳,電壓100V,時間25 min。最后在Bio-Rad自動凝膠成像儀上觀察PCR結(jié)果。

        1.2.4 帶型分析 以0、1為標(biāo)記,建立EXCEL分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫,0代表無條帶,1代表有條帶。

        2 結(jié)果與分析

        大量田間試驗(yàn)表明:通過離子注入后所獲得的早熟性狀和含糖率高的性狀是穩(wěn)定遺傳的。因此本研究對其進(jìn)行分子檢測,以期獲得與這些性狀緊密連鎖的標(biāo)記,并利用分子標(biāo)記來進(jìn)行輔助選擇育種或研究種質(zhì)資源。

        2.1 DNA的瓊脂糖電泳檢測

        在已有工作基礎(chǔ)上總結(jié)出一種簡單,成本低廉,提取DNA效果又好的SDS方法。采用此方法提取效率較高,主帶明亮,整齊一致,降解現(xiàn)象不明顯。

        2.2 RAPD體系的建立

        甜菜優(yōu)良親本7208、離子注入高糖突變體S10和早熟突變體W11為材料,以離子注入誘變早熟體的RAPD分子標(biāo)記篩選為技術(shù)基礎(chǔ)[8],根據(jù)其他作物的標(biāo)記體系進(jìn)行整合后,建立了適于甜菜的RAPD分子標(biāo)記體系。

        圖1 DNA檢測

        圖2 RAPD檢測

        此圖證實(shí)了用改良的SDS法提取DNA可以應(yīng)用到RAPD-PCR的擴(kuò)增體系。在C1、T20、AE20、U15、C2、C11引物下離子注入誘變體與非離子注入誘變體的DNA條帶有差異,同時兩個離子注入誘變體S10、W11之間也存在差異。

        2.2.1 多態(tài)性引物的確定 以 7208、S10、W11為材料,采用實(shí)驗(yàn)室建立起來的RAPD分子標(biāo)記技術(shù)體系,從800條RAPD引物中篩選出擴(kuò)增帶型有差異且?guī)颓逦€(wěn)定的引物。

        表1 鑒定材料間差異的DNA多態(tài)性引物

        從表1中看出有18個引物可以鑒別S10、7208之間的差異,也有18個引物可以鑒別W11、7208之間的差異。它們之間的引物并不是完全不同,V3、W5、C2、U15、AE20是它們共有的,占總引物的0.625%。有5個引物可以鑒別S10、W11之間的差異,占總引物的0.625%。由此可以證明雖然離子注入產(chǎn)生了高糖和早熟兩個變異體,但是它們之間的差異比較小,這主要是因?yàn)樗鼈兇蟛糠诌z傳物質(zhì)和親本7208相似。

        2.2.2 帶型統(tǒng)計(jì)分析 以0、1為標(biāo)記,建立EXCEL分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫,0代表無條帶,1代表有條帶。

        通過 7208、S10、W11的 RAPD 引物的篩選和特異性引物對應(yīng)的DNA指紋(見表2、3、4)統(tǒng)計(jì),可以建立相應(yīng)的RAPD分子標(biāo)記指紋圖譜庫,同時也可以看出:用一個引物很難確定是哪種變異,因此確定某一種變異應(yīng)用多個引物的組合或指紋組合。

        表2 引物所對應(yīng)的S10、7208的DNA指紋

        表3 引物所對應(yīng)的W11、7208的DNA指紋

        表4 引物所對應(yīng)的S10、W11的DNA指紋

        3 討論

        甜菜是兩年生作物,通過常規(guī)雜交轉(zhuǎn)育產(chǎn)生新的基因源,一則周期太長,二則在沒有基因來源的情況下,很難獲得新的創(chuàng)新材料。在甜菜理化誘變中,曾先后應(yīng)用航天、鈷60等誘變方法,但效果均不明顯。離子注入技術(shù)具有定向性、多樣性及安全性,有較高的突變譜。新疆在甜菜上利用離子注入技術(shù)獲得了創(chuàng)新早熟親本材料一份W11,含糖率增加的高糖親本一份S10,而且此種變異可以穩(wěn)定遺傳[8]。

        隨機(jī)引物多態(tài)性DNA片斷可作為分子標(biāo)記。這種方法即為RAPD。盡管RAPD技術(shù)誕生的時間很短,但由于其獨(dú)特的檢測DNA多態(tài)性的方式具有快速、簡便的特點(diǎn),使這個技術(shù)已滲透于基因組研究的各個方面。該RAPD技術(shù)建立于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上,它是利用一系列不同的隨機(jī)排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈為引物,對所研究基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[13]。聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離,經(jīng)EB染色或放射性自顯影來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片斷的多態(tài)性,這些擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片斷的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但對于任一特異的引物,它同基因組DNA序列有其特異的結(jié)合位點(diǎn)。這些特異的結(jié)合位點(diǎn)在基因組某些區(qū)域內(nèi)的分布如符合PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件,即引物在模板的兩條鏈上有互補(bǔ)位置,且引物3’端相距在一定的長度范圍內(nèi),就可以擴(kuò)增出DNA片斷。因此如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA片斷插入、缺失或堿基突變就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點(diǎn)分布發(fā)生相應(yīng)的變化,而使PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量的改變。通過對PCR產(chǎn)物檢測即可檢出基因組DNA的多態(tài)性。分析時可用的引物數(shù)量很大,雖然對每一個引物而言其檢測基因組DNA多態(tài)性的區(qū)域是有限的,但是利用一系列引物則可以使檢測區(qū)域幾乎覆蓋整個基因組。因此RAPD可以對整個基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性檢測。另外,RAPD片斷克隆后可作為RFLP的分子標(biāo)記進(jìn)行作圖分析。

        由本實(shí)驗(yàn)可知:利用RAPD檢測可以區(qū)分7208、W11、S10三者的差異并且通過分析也驗(yàn)證了突變的低頻性。利用RAPD檢測可以區(qū)分7208、W11、S10三者的差異,正好和大田上三者之間存在有差異的結(jié)果是一致的,表明三者之間可能存在遺傳物質(zhì)上的差異。同時RAPD檢測可以較早地對甜菜的種子進(jìn)行室內(nèi)檢測,從而更早地對誘變體進(jìn)行選擇。但是用RAPD進(jìn)行分子標(biāo)記,存在重復(fù)性差等局限性,因此為了彌補(bǔ)RAPD和大田檢測的局限性,還需要轉(zhuǎn)換一種SCAR的特異性的分子標(biāo)記技術(shù)來,更加準(zhǔn)確地鑒定出離子注入誘變產(chǎn)生的變異。

        4 結(jié)論

        本文通過RAPD分析得到了7208、W11、S10之間有差異的引物;通過帶型分析建立了7208、W11和S10的指紋圖譜庫。由實(shí)驗(yàn)可知:利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)檢測了甜菜突變體,檢測差異的大小和大田檢測進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果是基本一致的,從而也證明了RAPD分子標(biāo)記技術(shù)是可以用于檢測生物的突變體的,因此用RAPD分子標(biāo)記對7208、W11、S10之間的差異進(jìn)行監(jiān)測,在早代進(jìn)行選擇,可以指導(dǎo)大田育種。再通過大田育種的結(jié)果來驗(yàn)證分子育種的可行性,以確認(rèn)標(biāo)記的準(zhǔn)確性。

        [1]劉勛甲,鄭用璉,石勇剛,等.玉米RAPD研究影響因素的探討[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1996,15(5):405-409.

        [2]Staub JE,Serquen FC.Genetic markers,map constrution,and their applicationg in plant breeding.HortScience,1996,31(5):729-741.

        [3]廖江雄.復(fù)雜多倍體植物甘蔗分子標(biāo)記的研究現(xiàn)狀及展望[J].甘蔗,1998,5(2):10-15.

        [4]史永忠,郭文武,鄧學(xué)新.柑橘RAPD技術(shù)體系建立與體系胞雜種鑒定[J].園藝學(xué)報(bào),1998,25(2):105-110.

        [5]李富生,何麗蓮,楊清輝,等.蔗茅的特異性狀及其與甘蔗雜交F1代的染色體和RAPD鑒定研究[J].分子植物育種,2003,1(5):775-781.

        [6]曾華宗,鄭成木,朱穩(wěn),等.甘蔗種質(zhì)間親緣關(guān)系及特異性標(biāo)記的RAPD分析[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2003,4(2):99-103.

        [7]肖關(guān)麗,李富生,楊清輝,等.RAPD分子標(biāo)記在甘蔗雜種鑒定中的應(yīng)用研究[J].西南農(nóng)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,25(3):207-209.

        [8]王燕飛,陳麗君,劉華君,等.我國甜菜誘變育種方法研究進(jìn)展[J].中國糖料,2008(4):66-68.

        [9]許莉萍,陳如凱.與甘蔗抗黑穗病基因連鎖的RAPD標(biāo)記篩選[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2004,10(3):263-267.

        [10]陳平華,張輝,陳如凱.利用RAPD技術(shù)進(jìn)行甘蔗育種親本輔助選擇[J].分子植物育種,2004,2(5):675-681.

        [11]曲延英,王燕飛,高文偉,等.甜菜離子注入誘變早熟突變體的RAPD分子標(biāo)記篩選[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,42(4):287-289.

        [12]張玉,李偉,魏育明,等.小麥抗赤霉病地方品種的RAPD分析[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2005,18(3):240-243.

        [13]苗玉新,劉麗艷,包春蓮.PCR和RAPD技術(shù)在農(nóng)業(yè)研究中的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)系統(tǒng)科學(xué)與綜合研究,2005,21(3):84-89.

        猜你喜歡
        離子注入甜菜突變體
        基于全球離子注入機(jī)行業(yè)現(xiàn)狀探析中國離子注入機(jī)突破之路
        甜菜應(yīng)答鹽脅迫的RING型E3連接酶基因的鑒定與分析
        辣椒甜菜,各有所愛
        離子注入常見問題分析與研究
        CLIC1及其點(diǎn)突變體與Sedlin蛋白的共定位研究
        新疆產(chǎn)區(qū)有機(jī)甜菜栽培技術(shù)探討
        中國糖料(2016年1期)2016-12-01 06:49:04
        擬南芥干旱敏感突變體篩選及其干旱脅迫響應(yīng)機(jī)制探究
        Survivin D53A突變體對宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響
        二二三團(tuán)甜菜主要病蟲害發(fā)生特點(diǎn)及防治
        磷酸三酯酶突變體H23A的真核表達(dá)及性質(zhì)表征
        99国产超薄丝袜足j在线播放| 少妇做爰免费视频了| 亚洲av无码xxx麻豆艾秋| 精品国产网红福利在线观看| 国产小车还是日产的好| 99久久国产精品免费热| 久久精品一区二区三区夜夜| 夜夜骚久久激情亚洲精品| 亚洲av鲁丝一区二区三区黄| 国产成人综合一区二区三区| 中文熟女av一区二区| 亚洲视频在线免费不卡| 天下第二社区在线视频| 久久99精品国产99久久6男男| 人妖另类综合视频网站| 亚洲国产91精品一区二区| 又粗又黑又大的吊av| 久久国产色av| 色人阁第四色视频合集网| 日韩一区二区三区精品视频| 99国产精品久久久蜜芽| 欧美色欧美亚洲另类二区不卡| 蜜臀av人妻一区二区三区| 最新国产不卡在线视频| 久久国产劲暴∨内射| 国产精品1区2区| 日韩av中文字幕波多野九色| 强开少妇嫩苞又嫩又紧九色| 久草热8精品视频在线观看| 亚洲免费观看一区二区三区| 一本一道久久综合久久| 久久99精品国产麻豆宅宅| 中文字幕久久久久人妻无码| 国产成人亚洲综合二区| 人妻丰满熟av无码区hd| 亚洲av成人精品日韩一区| 日韩成人精品一区二区三区| 二区三区三区视频在线观看| 无码人妻久久一区二区三区不卡| 一区二区三区内射视频在线观看| 国产91极品身材白皙|