楊 昆 ，應雄美，管永江，馬 麗，吳才文

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，開遠661600；2.云南省紅河學院生命科學與技術(shù)學院，蒙自661100）

親本之間花期同步是進行有性雜交育種的前提和條件。甘蔗及其近緣屬種之間花期不遇，諸多優(yōu)異種質(zhì)難以雜交利用，導致其育種基礎狹窄、血緣單一，使甘蔗育種處于擁有大量種質(zhì)資源的同時又被育種血緣貧乏所困擾的被動局面[1]。

斑茅（S.arundinaceum）是多年生草本，屬于甘蔗近緣屬野生種。以優(yōu)異的抗性、強宿根性、耐粗生和廣適應性使其在甘蔗近緣屬植物資源中占有重要地位，多年來，一直被甘蔗育種家們作為品種改良和突破性品種培育的重要資源；但是，由于它的花期普遍較甘蔗親本早3～6個月，使其優(yōu)異特性的利用大打折扣。多年來，為尋求調(diào)節(jié)不同屬種和雜交雙親花期一致的方法，甘蔗種質(zhì)創(chuàng)新科技工作者進行不懈的努力。近幾十年來發(fā)展起來的花粉低溫貯藏技術(shù)，以少投入，高效率，有性雜交靈活方便，不受時間、地點、空間和自然條件的限制等優(yōu)點，引起了國內(nèi)外育種工作者的高度重視，并進行了大量的研究[2－8]。本文對不同地理來源斑茅的抽穗開花習性進行觀察并對花粉貯藏技術(shù)進行探索，以期為更多珍貴斑茅資源的有效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以21份不同地理來源的斑茅無性系為材料，觀察其抽穗開花特性，選取其中的無性系2～4條花穗作為花粉供體，研究其花粉貯藏技術(shù)；所有斑茅無性系材料來源于云南省農(nóng)科院開遠甘蔗研究所國家甘蔗種質(zhì)資源圃。

1.2 試驗方法

1.2.1 花穗及花藥田間性狀觀察 自7月中旬起，觀察21份斑茅無性系，以最先抽穗的斑茅無性系花穗抽出5cm劍葉時的日期為初始日期，觀察、記錄各個無性系包括從抽穗初期到抽穗末期的時間、完全抽穗后的花穗長度。

1.2.2 花粉收集及統(tǒng)計 斑茅盛花期在7月下旬至10月上旬，于每日下午4時至5時，觀察斑茅無性系開花情況，選擇其中抽穗2/3但未盛開的斑茅花穗無性系材料，剪取單株穗莖（帶葉片）帶回室內(nèi)進行自來水養(yǎng)莖，每個無性系材料取 2～4條花穗，于次日8—9時收集花粉。

（1）花粉量測定采用同心圓法[3]：將盛開的花穗懸于潔凈光滑的藍色硬紙上，輕輕抖動，收集花粉，去除花藥壁等雜質(zhì)后，將花粉均勻攤平于白色硬紙的固定區(qū)域（半徑分別為1、2、3、4cm的同心圓）內(nèi)評級，分別評為“少”、“中”、“多”、“很多”4 級（同心圓法）。

（2）花粉量測定采用血球計數(shù)器法[9]：取斑茅不同無性系的1～2個花穗，采集充分成熟、飽滿、未開裂的花藥90枚，平均放入清洗干凈的3個IP管中，自然干燥。待花粉充分散出后，每瓶滴入1%六偏磷酸鈉溶液1mL，加蓋充分搖勻，使花粉呈懸浮狀態(tài)。然后吸取2～3滴懸浮液滴于血球計數(shù)板（16×25規(guī)格），顯微鏡下觀察400個小方格的花粉粒數(shù)。每個材料重復9次，取平均值，經(jīng)換算得出各材料每個花藥花粉數(shù)量（N）：

N=（400 小方格內(nèi)花粉數(shù)×10000×1）/30

1.2.3 花粉可育率的測定 將收集到的斑茅無性系花粉，分別撒在載玻片上，滴上少量的碘液，置于顯微鏡（10×40）下觀察。凡是花粉粒成球形且被染成藍褐色的可視為有活性的花粉，而呈三角形的或皺縮且未被染色或染色很淺的為沒有活性的花粉。連續(xù)觀察3個視野，平均后計算斑茅花粉的可育率。

可育率（%）=視野中被染色的花粉粒數(shù)/視野中所有的花粉粒數(shù)×100%。

1.2.4 花粉干燥及含水量的測定 測定花粉含水量時，將收集到的斑茅無性系花粉轉(zhuǎn)移至潔凈干燥的培養(yǎng)皿內(nèi)，攤平，分別進行常溫下3種不同干燥處理：自然干燥、硅膠干燥、抽真空干燥，干燥時間分別定為0、0.5h、1h、2h、3h，然后用MA100型紅外水分測定儀（德國Sartorius）測定各處理花粉的含水量。

1.2.5 干燥處理低溫貯藏后花粉活性的檢測 將上述部分干燥處理后的斑茅無性系花粉轉(zhuǎn)入潔凈干燥的1.5mL的離心管中，用石蠟進行封存后，放入冰箱中進行不同低溫處理（2℃、-20℃、-70℃）的貯藏試驗，10d后再用培養(yǎng)法測定各處理花粉的生活力。用培養(yǎng)法檢測經(jīng)不同干燥處理的斑茅花粉的生活力，即：在凹型載玻片上滴1滴培養(yǎng)液 （100mL蒸餾水＋15g蔗糖＋0.05g硼酸＋0.03g硝酸鈣＋0.01g硝酸鉀＋0.02g硫酸鎂＋0.5瓊脂）[5,10-11]，然后用毛筆蘸斑茅花粉，在有培養(yǎng)液的載玻片上均勻撒上斑茅花粉，將玻片放入墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，放入26±2℃的恒溫恒濕的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2h后，置于顯微鏡下觀察花粉管的萌發(fā)情況。每個處理連續(xù)觀察5個視野，最后統(tǒng)計出各處理的花粉萌發(fā)率。

3 結(jié)果與分析

3.1 斑茅抽穗開花特性的差異

斑茅的開花特性受原生地及海拔高度的影響較大。從表1可以看出不同無性系斑茅的抽穗期、開花類型、花粉量、花粉活性都存在較大的種內(nèi)及地域差異。對表1數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析表明抽穗期與原生地海拔高度呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=0.7047**。而其性狀皆表現(xiàn)出一定的負相關(guān)，但相關(guān)性不明顯，花穗長度與原生地海拔相關(guān)系數(shù)為r=﹣0.081，花粉活性與原生地海拔間相關(guān)系數(shù)為r=﹣0.378，花粉活性與花穗長度相關(guān)系數(shù)為r=﹣0.228。從開花類型看，可分為6類，一類為全抽出后開花，占28.57%；二類為抽出2/3即開花，占4.76%；三類為抽出1/2即開花，占9.5%；四類為抽出1/3即開花，占23.8%；五類為抽出1/5即開花，占28.57%；六類為抽出即開花，占4.76%。從數(shù)據(jù)上看，全抽出后開花和抽出1/5即開花占了大部分，今后雜交利用時對花粉的采集可依據(jù)開花類型進行調(diào)整，使采集的花粉萌發(fā)率達到最大。

表1 不同斑茅無性系的抽穗開花特性

3.2 花粉量與花粉活性的關(guān)系

研究花粉量與花粉萌發(fā)率之間的關(guān)系將有利于提高斑茅雜交利用的授粉效率。在檢測花粉量時，21個斑茅無性系材料全部采用同心圓法，取其中8個無性系材料進行血球計數(shù)法，相比同心圓法測量，血球計數(shù)板能精確測量花粉粒個數(shù)，而同心圓法在實際操作中更簡便、直接反映花粉量多少。分析表2發(fā)現(xiàn)，在同一省份（如云南）不同海拔下，不同斑茅無性系材料的花粉量與花粉萌發(fā)率之間存在顯著相關(guān)（r=0.7077**），說明云南斑茅無性系花粉的活性隨著花粉量的增加而增大；隨著海拔的增加，斑茅花粉量有減少的趨勢；其余地區(qū)的斑茅因材料數(shù)太少，暫不能進行規(guī)律性總結(jié)。

表2 不同斑茅無性系花粉量和花粉萌發(fā)率測定結(jié)果

3.3 不同干燥處理及低溫貯藏對斑茅花粉生活力的影響

研究斑茅花粉在不同干燥處理及低溫貯藏下的生活力差異將有利于篩選出適合斑茅花粉貯藏的有利條件，提高斑茅雜交利用的效率。以斑茅（云南82-69）花粉為試驗材料，比較不同干燥處理、不同低溫貯藏條件對斑茅花粉萌發(fā)率的影響。從表3可以看出：（1）貯藏前的斑茅花粉生活力隨著干燥時間的延長而降低，在自然條件下干燥3h，斑茅花粉生活力降到1.42%；硅膠干燥3h，斑茅花粉生活力降到2.24%，相比之下，抽濕干燥效果較明顯，但對花粉細胞的損傷也是最大的，干燥3h后，斑茅花粉沒有生活力。（2）斑茅花粉含水量隨干燥時間延長而降低，比較3種干燥方式，抽濕干燥比硅膠干燥和自然干燥能更快地降低斑茅花粉含水量，硅膠干燥好于自然干燥。（3）貯藏前含水量的多少是影響斑茅花粉在貯藏過程中活力好壞的一個重要因素，因抽濕干燥對細胞傷害較大，造成在低溫貯藏過程中花粉沒有生活力。在本試驗中，比較自然干燥和硅膠干燥斑茅花粉后的貯藏效果，含水量在4.3%～6.6%之間，貯藏10d的花粉有一定的活性。（4）在相同貯藏天數(shù)下，比較3種低溫（2℃、-20℃、-70℃）貯藏下花粉活力的下降比率，隨著溫度的降低，花粉活力也在逐漸地下降，相比之下，硅膠干燥2h后，在2℃下貯藏花粉活力下降比率最低，僅為28.0%，其余低溫貯藏的花粉活力下降比率都在40%以上，說明斑茅花粉經(jīng)硅膠干燥2h后在2℃的低溫貯藏效果較其它方式處理的要好。

表3 不同干燥處理及低溫貯藏對斑茅花粉生活力的影響

4 討論

（1）來源低海拔斑茅無性系材料的抽穗期較高海拔的斑茅無性系的抽穗期短，這與李富生[5]對蔗茅無性系的研究結(jié)果一致；說明低海拔區(qū)的溫度較高，條件適宜，從而縮短了斑茅的抽穗開花時間；來自較高海拔地區(qū)的斑茅，由于溫度較低，為了使自己能夠在最適合的時機繁衍后代，它必須在不利的條件下，盡量延長自己的抽穗開花期，從而保證物種的延續(xù)。

（2）本試驗中較好的低溫貯藏條件為硅膠干燥2h，含水量在4.3%～6.6%，在2℃的低溫條件下貯藏，這與前人研究其他植物花粉低溫貯藏時含水量降到10%以下的結(jié)果一致[12]；花粉含水量越高，進行冷凍時越容易形成冰晶，使細胞膜受損，花粉死亡率就越高，不能達到貯藏的目的[2]。

（3）本文對不同無性系斑茅的開花習性及花粉貯藏條件進行了觀察和初步探索，如果讓斑茅花粉在相對長的貯藏時間下，達到最大的活性，今后還需做更加深入的研究。

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