史樹德，魏 磊，張子義，邵金旺，田自華

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)甜菜生理研究所，呼和浩特 010018）

甜菜是我國主要經(jīng)濟作物之一，其不僅是主要的制糖工業(yè)原料，也是發(fā)展畜牧業(yè)的優(yōu)良飼料，更是新興的能源作物，在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和發(fā)展地方經(jīng)濟中占有重要地位。但由于中國不是甜菜起源國，缺少種質(zhì)資源，再加之相關(guān)研究積淀較薄，使我國的甜菜研究水平整體落后，甜菜育種水平落后于發(fā)達國家。而隨著基因組學(xué)研究的飛速發(fā)展，分子設(shè)計育種成為作物遺傳改良的重要途徑之一，新的分子標(biāo)記不斷被開發(fā)和廣泛應(yīng)用，從而加速了作物基因組輔助育種和設(shè)計育種的進程[1]。近幾年，國內(nèi)外在甜菜分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究正在興起，但可利用分子標(biāo)記的匱乏嚴(yán)重制約其發(fā)展。目前，在甜菜基因組輔助育種研究中應(yīng)用到的分子標(biāo)記十分有限，僅有關(guān)于 RAPD[2－6]、AFLP 和 SNP[7]以及少數(shù) SSR[8－11]、ISSR[12]標(biāo)記的初步報道，其中可利用的甜菜SSR標(biāo)記很少。

簡單序列重復(fù)（simple sequence repeats，SSRs）或微衛(wèi)星（microsatellites）是以 1～6個堿基為基元的串聯(lián)重復(fù)序列，它們普遍存在和均勻分布于大多數(shù)真核生物的基因組中，重復(fù)數(shù)高度變異[13－15]。SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、容易用PCR檢測、重復(fù)性高等特點，作為理想的分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用到許多植物的遺傳學(xué)研究中[16－18]。SSR標(biāo)記的開發(fā)有幾種[19-22]。EST-SSR是近年發(fā)展起來的新型分子標(biāo)記，作為表達基因部分序列的EST和cDNA數(shù)據(jù)近年來高速增加。截至2011年3月1日，GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST）中的甜菜EST數(shù)據(jù)已有29830條。EST-SSR反映了基因的編碼部分，可以直接獲得基因表達的信息，為功能基因提供“絕對”的標(biāo)記，使得有可能對決定重要表型或農(nóng)藝性狀的等位基因進行直接鑒定，省去了SSR引物開發(fā)過程中的克隆和測序步驟，充分利用了現(xiàn)有測序數(shù)據(jù)，降低了開發(fā)成本，EST-SSR的開發(fā)在多種作物中已有報道[23-27]。

為此，本研究目的是利用GenBank中已有的EST序列，開發(fā)基于EST序列的SSR標(biāo)記，并用其進行甜菜種質(zhì)資源的遺傳多樣性驗證，以篩選多態(tài)性高、重復(fù)性好的EST-SSR標(biāo)記；評價收集的甜菜種質(zhì)資源遺傳多樣性，為建立甜菜高密度遺傳圖譜、功能性分子標(biāo)記發(fā)掘、重要農(nóng)藝性狀QTLs克隆等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗所用甜菜品種為甜研309和KWS9412，KWS9419，KWS5416，農(nóng)大甜研4號和包育302，種植于溫室，采用CTAB法[28]提取甜菜苗期新鮮葉片基因組DNA。

1.2 EST-SSR的引物開發(fā)

首先計算機安裝PC版perl程序，然后從GenBank/dbEST（http：//www.ncbi.nlm.nih/entrez）中以FASTA格式下載sugar beet和Beta vulgaris L.中所有的EST序列，共29830條。 利用Blastclust（v.2.2.10；http：//www.ncbi.nih.gov/web/newsltr/spring04/blastlab.htm）軟件，對這些EST序列進行冗余性查找，利用CD_HIT（http：//www.bioinformatics.org/cd-hit/）快速批量去冗余序列；利用 est_timmer（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）去除EST 序列中過短的序列（＜100bp）和過長的序列（＞700bp）以及 mRNA 的“帽子”和“尾巴”，利用 misa.pl（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）識別和定位SSR，其中配置文件misa.ini用來設(shè)置識別SSR標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)；利用primer3模塊批量設(shè)計SSR引物，引物設(shè)計的主要參數(shù)是，引物長度20～26bp；退火溫度Tm值48℃～65℃；（G＋C）含量30%～70%；PCR擴增產(chǎn)物長度大于150bp；利用MacVector7.0軟件對所設(shè)計的引物進行驗證，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 EST-SSR的擴增與檢測

PCR反應(yīng)在25μL的體積中進行，含PCR緩沖液、50～80 ng的模板DNA、1.5 U Taq聚合酶，上、下游引物各0.5μmol/L、200μmol/L dNTP和2.0 mmol/L MgCl2。整個反應(yīng)過程在PE 9700上進行，循環(huán)條件是：94℃預(yù)變性3min；然后35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性45s，復(fù)性的合適溫度通過溫度梯度實驗確定，并盡可能提高復(fù)性溫度以增加特異性，復(fù)性時間60s，72℃延伸1min 20s；最后于72℃延伸8min。復(fù)性溫度低于50℃仍無產(chǎn)物出現(xiàn)，則認(rèn)為該引物不能擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 多態(tài)信息含量和遺傳相似系數(shù)分析

多態(tài)信息含量常被用來評估所設(shè)計引物的潛在利用率。本實驗的每個EST-SSR引物的多態(tài)信息含量按Park等[29]提供的公式計算，即其中Pi為i位點的基因頻率，n為等位基因數(shù)。遺傳相似系數(shù)分析利用NTSYS-pc軟件[30]的SIMQUAL模塊計算6個甜菜品種間的遺傳相似系數(shù)。然后基于遺傳相似系數(shù)矩陣，依據(jù)UPGMA算法并利用NTSYS-pc軟件的SHAN聚類程序?qū)?個材料進行聚類分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 甜菜EST-SSR的特征

從NCBI網(wǎng)站下載的29830條主要來源于sugar beet和Beta vulgaris L.的EST序列（截止2011年3月1日）。經(jīng)過除去ploy A或T“尾巴”和載體等序列后共獲得20109條無冗余EST序列，序列總長度為11287687bp。按照上述查找標(biāo)準(zhǔn)，共發(fā)現(xiàn)6951條至少含有1個SSR的EST序列，占無冗余EST總數(shù)的34.6%，表明甜菜EST-SSR含量比較豐富。按照SSR具體實驗引物設(shè)計要求，從4338個SSR重復(fù)中設(shè)計得到2845對EST-SSR引物。這些引物對中有1052個含有1個SSR重復(fù)，其余1793對含有2個或2個以上的SSR重復(fù)。在鑒定的SSR中A/T單堿基重復(fù)最多，其最少重復(fù)9次，最大重復(fù)28次；AAG/CTT三核苷酸重復(fù)次之，最少重復(fù)5次；AG/CT二核苷酸重復(fù)居第三，最少重復(fù)6次；四、五和六核苷酸重復(fù)數(shù)量最少，其最少重復(fù)5次（見表1）；在同一條EST序列中所含2個SSR位點之間最小相距2個核苷酸，最大相距100個核苷酸。其中除單核苷酸重復(fù)外，AAG/CTT三核苷酸重復(fù)基元是出現(xiàn)頻率最高的EST-SSR類型，占總SSR的12.7%，AG/CT次之，占10.4%，ACCTCC/AGGTGG等六核苷酸重復(fù)最少，約占1%。

表1 在20109條甜菜EST序列中發(fā)掘的不同基元的SSR數(shù)量及百分率統(tǒng)計

2.2 EST-SSR引物的擴增效率

在所得的2845對SSR引物中隨機挑選并合成了100個SSR引物對，在前述給定的條件下對6個品種甜菜基因組DNA進行PCR擴增，有47對（47%）引物擴增出了SSR特征條帶，共產(chǎn)生621個位點，平均每對引物產(chǎn)生13.2個位點。表2為47個具有功能性引物對的相關(guān)信息。在47個功能性引物對中，有14個引物對（29.7%）擴增出1條產(chǎn)物帶，有25個引物對（31.9%）擴增出2條條帶，8個引物對（17.2%）擴增出2條以上條帶；有38個引物對的擴增產(chǎn)物在預(yù)期片段大小范圍之內(nèi)，占功能性引物對的80.8%，9個引物對的擴增產(chǎn)物小于預(yù)期片段大?。淮送?，在33個擴增出2條或2條以上條帶的引物對中，有9個引物對擴增出比預(yù)期片段大的條帶，在47個功能性引物對中，有25個引物對在6個甜菜品種間擴增出多態(tài)性，多態(tài)性引物對占53.2%。25個引物對在6個品種中共擴增出138個多態(tài)性標(biāo)記。

2.3 EST-SSR引物的多態(tài)性分析

每對引物的多態(tài)性信息含量用PIC值表示，并用量估計等位基因的變異情況。依據(jù)47對引物在6個甜菜品種中擴增得到的等位基因的變異信息來計算各引物的PIC值。它們的PIC值變化在0.13～0.71之間，平均為0.47，引物S9的PIC值最大，達0.71；而引物S10的最小，只有0.13。

2.4 遺傳相似系數(shù)分析

基于這 25個多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記，依據(jù)UPGMA算法利用NTSYS-pc2.1軟件將本研究所用6個甜菜品種進行聚類分析，可將6個品種劃分為不同的兩組（圖1）：第一組為國內(nèi)品種，其中甜研309與農(nóng)大甜研4號和包育302親緣關(guān)系較遠，第二組為親緣關(guān)系較近的德國KWS系列3個品種，系統(tǒng)發(fā)育分析表明國內(nèi)外兩組材料親緣關(guān)系較遠，遺傳相似度較低，相似系數(shù)為0.31。

表2 甜菜ESTs中分離到的部分微衛(wèi)星引物

3 討論

與其他分子標(biāo)記相比，EST-SSR標(biāo)記來自表達基因的全部或部分序列，其多態(tài)性可能直接與該基因功能相聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，水稻的蠟質(zhì)基因5'端非編碼區(qū)中的SSR序列（CT）n長度變化不僅與直鏈淀粉的含量有關(guān)[31]，而且還決定了糯稻淀粉的理化特性[32]。因此根據(jù)EST包含的SSR位點開發(fā)的分子標(biāo)記，是直接與功能相關(guān)的功能標(biāo)記[33]，EST-SSR標(biāo)記的這一特點決定了其在功能基因標(biāo)記方面應(yīng)用前景廣闊。

本研究中，多態(tài)信息位點PIC值變化在0.13～0.71之間，較已知甜菜SSR標(biāo)記PIC值低[34]，可能是由于EST標(biāo)記來源于基因編碼區(qū)，具有很高的保守性，因此它們在品種之間的多態(tài)性要低于來源其它基因組區(qū)域分子標(biāo)記[35]，但是通過根據(jù)EST 5'端或3'端的UTR區(qū)開發(fā)的SSR標(biāo)記多態(tài)性要稍好些[33]。因此，在設(shè)計引物時，可設(shè)定軟件條件，應(yīng)盡量使引物靠近3'或5'端非編翻譯區(qū)。本研究中較低的PIC值與張艷欣和Taliercio等人的研究結(jié)果一致[36，18]，表明基于表達基因的EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性確實低于基因組SSR[37]。在100對引物中有47對成功擴增出了SSR特征條帶，其它未獲得擴增產(chǎn)物的引物可能的原因是正向引物或反向引物或二者都恰好跨過了mRNA的剪切位點，也可能是由于在相應(yīng)的基因組DNA中存在較大的內(nèi)含子，這兩個原因都會導(dǎo)致引物無法與模板DNA結(jié)合而不能擴增，從而導(dǎo)致擴增效率較低?；谶z傳相似系數(shù)的聚類分析表明，國內(nèi)和國外品種間遺傳差異度較大，可能是其親本來源不同所致。本研究中，三核苷酸重復(fù)數(shù)量高于二核苷酸重復(fù)，此結(jié)果與EST中三核苷酸比二核苷酸更為豐富的結(jié)論相符[32]。

綜上，EST-SSR標(biāo)記易于開發(fā)、成本較低，其功能可以通過序列同源性比對獲得。而且由于來自于轉(zhuǎn)錄譜，能夠反映出轉(zhuǎn)錄區(qū)的差異，使得EST-SSR標(biāo)記在遺傳多樣性分析、比較作圖和分子標(biāo)記輔助選擇育種的研究中具有更高的應(yīng)用價值。

[1]Peleman J D，van der Voort J R.Breeding by design[J].Trends Plant Sci.，2003，8（7）：330-334.

[2]張福順.葉用甜菜種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系的研究[D].哈爾濱：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，1999.

[3]UphoffH，WrickeG.Ageneticmapofsugarbeet（BetaVulgarisL.） basedonRAPDmarkers[J].PlantBreeding，1995，114（4）：355-357.

[4]路運才.甜菜多倍體品種和親本的生物學(xué)特性及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究[D].哈爾濱：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，2001.

[5]Askar，N.A.，Reza，A.，Ali，H.N.，Jalal，S.，Mahmood，M.Use of Molecular Marker for Assay Gene Dosage Resistant Gene to Rhizomania Disease （Rz1） in Sugar beet（Beta vulgaris L.） [J].Asian J.of Biotech.， 2009，1（1）：7-41.

[6]Amiri R.，Mesbah M.，Moghaddam M.，Bihamta M.R.，Mohammadi S.A.and Norouzi P.A new RAPD marker for beet necrotic yellow vein virus resistance gene in Beta vulgaris[J].Biologia Plantarum，2009，53（1）：112-119.

[7]Grimmer M.K.，Trybush S.，Hanley S.，F(xiàn)rancis S.A.，Karp A.and Asher M.J.C.An anchored linkage map for sugar beet based on AFLP，SNP and RAPD markers and QTL mapping of a new source of resistance to Beet necrotic yellow vein virus[J].Theoretical and Applied Genetics.，2007，114（7）：1151-1160.

[8]Annika Hjerdin Panagopoulos.Application of Molecular Markers in Sugar Beet Breeding[D].Lund：Lund University，2003.

[9]Schneider K，Sch?fer-Pregl R，Borchardt C and Salamini F.Mapping QTLs for sucrose content，yield and quality in a sugar beet population fingerprinted by EST-related markers[J].Theor.Appl.Genet.，2002，104（6-7）：1107-1113.

[10]趙尚敏，白晨，張惠忠，等.適于甜菜遺傳多樣性分析的SSR引物篩選[J].中國糖料，2009（4）：6-8.

[11]王華忠，吳則東，王曉武，等.利用SRAP與SSR標(biāo)記分析不同類型甜菜的遺傳多樣性[J].作物學(xué)報，2008，34（1）：37-46.

[12]付增娟，史樹德，張少英，等.甜菜ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].中國糖料，2008（4）：7-9.

[13]Powell W，Machray G C，Provan J.Polymorphism revealed by simple sequence repeats[J].Trends Plant Sci.，1996，1（7）：215-222.

[14]TóthG，GáspáriZ，JurkaJ.Microsatellitesindifferenteukaryoticgenomes：surveyandanalysis[J].GenomeResearch，2000，10（7）：967-981.

[15]Tautz D，Renz M.Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes[J].Nucleic Acids Research，1984，12（10）：4127-4138.

[16]朱振東，賈繼增.小麥 SSR 標(biāo)記的發(fā)展及應(yīng)用[J].遺傳，2003，25（3）：355-360.

[17]Blair M W，Giraldo M C，Buendía H F，et al.Microsatellite marker diversity in common bean （Phaseolus vulgaris L）[J].Theor.Appl.Genet.，2006，113（1）：100-109.

[18]Rongwen J，Akkaya M S，Bhagwat A A，et al.The use of microsatellite DNA markers for soybean genotype identification[J].Theor.Appl.Genet.，1995，90（1）：43-48.

[19]張亞平，王文，宿兵，等.大熊貓微衛(wèi)星DNA的篩選及其應(yīng)用[J].動物學(xué)研究，1995，16（4）：301-306.

[20]Rassmann K，Sehlotterer C，Tautz D.Isolation of simple sequence loci for use in Polymerase chain Reaction-based DNA finger printing[J].Electrophoresis，1991，12（2-3）：113-118.

[21]Karagyozov L，Kalcheva I D，Chapman V M.Construction of random small-insert genomic libraries highly enriched for simple sequence repeats[J].Nucleic Acids Research，1993，21（16）：3911-3912.

[22]Lian C L，Zhou Z H，Hogetsu T.A simple method for developing microsatellite markers using amplified fragments of intersimple sequence repeat[J].Journal of Plant Research，2001，114（3）：381-385.

[23]Taliercio E，Allen R D，Essenberg M，et al.Analysis of ESTs from multiple Gossypium hirsutum tissues and identification of SSRs[J].Genome，2006，49（4）：306-319.

[24]Scott K D，Eggler P，Seaton G，et al.Analysis of SSRs derived from grapes EST[J].Theor.Appl.Genet.，2000，100（5）：723-726.

[25]Eujayl I，Sorrells M E，Wolters P，et al.Isolation of EST-derived microsatellite markers for genotyping the A and B genomes of wheat[J].Theor.Appl.Genet.，2002，104（2-3）：399-407.

[26]Rungis D，Berube Y，Zhang J，et al.Robust simple sequences repeat markers for spruce （Picea spp.） from expressed sequence tags[J].Theor.Appl.Genet.，2004，109：1283-1294.

[27]魏利斌，張海洋，鄭永戰(zhàn)，等.芝麻EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)和初步研究[J].作物學(xué)報，2008，34（12）：2077-2084.

[28]Doyle J J，Doyle J L.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.Phytochemical Bulletin，1987，19：11-15.

[29]Park Y H，Alabady M S，Ulloa M，et al.Genetic mapping of new cotton fiber loci using EST-derived microsatellites in an interspecific recombinant inbred （RIL） cotton population[J].Mol Genet Genom，2005，274（4）：428-441.

[30]Rohlf F J.NTSYS-pc：Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System，Version 2.1，User Guide[CP].Exeter Software，New York，2000.

[31]Ayers，N.M，McClung，A.M，Larkin，P.D，et al.Microsatellites and a single nucleotide polymorphism differentiate apparent amylose classes in an extended pedigree of US rice germplasm[J].Theor.Appl.Genet.，1997，94：773-781.

[32]Bao J S，Corke H，Sun M.Microsatellites in starch synthesizing genes in relation to starch Physiochemical Properties in waxy rice（Oryza sativa L.）.Theor.Appl.Genet.，2002，105（6-7）：898-905.

[33]Thiel T，Michalek W，Varshney R K，et al.Exploiting EST databases for the development and characterization of gene-derived SSR-markers in barley （Hordeum vulgare L.） [J].Theor.Appl.Genet.，2003，106：411-422.

[34]Christopher M.R，Mary B，Sharon e.M，et al.Polymorphic microsatellite markers for inferring diversity in wild and domesticated sugar beet（Beta vulgaris L.） [J].Molecular Ecology Notes，2004，4：243-245.

[35]Eujayl l，Sorrells M E，Baum M，wolters et al.Assessment of genotypic variation among cultivated durum wheat based on ESTSSRs and genomic SSRs[J].EuPhytica，2001，119（1）：39-43

[36]張艷欣，林忠旭，李武，等.海島棉EST-SSR引物的開發(fā)與應(yīng)用研究 [J].2007，52（15）：1779-1787.

[37]Zhang L Y，Bemard M，Uroy P，F(xiàn)euillet C.High transferability of bread wheat EST-derived SSRs to other cereals[J].Theor.Appl.Genet.，2005，111：677-687.