楊文婷，吳 衛(wèi)，蔡乾蓉，徐應(yīng)文，魏 超

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，雅安 625014）

甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertoni），簡稱甜菊，為菊科甜葉菊屬多年生草本植物，原產(chǎn)南美巴拉圭一帶，于1976年在我國引種試種成功[1]。甜葉菊富含甜菊苷（stevioside，簡稱ST苷）、萊鮑迪苷A（rebaudioside A，簡稱RA苷）等糖苷類物質(zhì)，RA糖苷的甜度為蔗糖350～450倍[2]，熱量僅為蔗糖的1/300，且味質(zhì)好，口感最接近于蔗糖，是一種新型的綠色保健型甜味劑；ST糖苷的甜度為蔗糖的250～300倍[2]，有后苦味，作為甜味劑品質(zhì)不及RA苷，但ST糖苷有很好的抗癌活性[3]和降低Ⅱ型糖尿病血糖濃度和控制高血壓的作用[4-6]，在開發(fā)為醫(yī)藥保健產(chǎn)品上潛力巨大。甜葉菊中糖苷類成分結(jié)構(gòu)相似，功能和作用卻不盡相同，對于作為糖用或藥用型的甜葉菊品種，生產(chǎn)上不僅要求其具備相應(yīng)的高RA苷或高ST苷含量，還要求其高RA/ST比值或高ST/RA比值以利于工業(yè)生產(chǎn)中的提取分離。近年來，四川開始大面積栽種甜葉菊，本課題組于2007-2008年間從四川蒲江、綿陽、遂寧等地收集甜葉菊材料，優(yōu)選單株，經(jīng)連續(xù)3年的栽培觀測和分類篩選，逐步選育形成4個比較有代表性的甜葉菊品系SR-1，SR-2，SR-3，SR-5。本文旨在對新選育出的4個甜葉菊品系的一些基本農(nóng)藝性狀、莖葉產(chǎn)量及品質(zhì)指標(biāo)糖苷含量進(jìn)行考察比較和相關(guān)分析，為不同用途的甜葉菊育種提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

甜葉菊原始材料于2007—2008年收集自四川蒲江、綿陽、遂寧等地，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)吳衛(wèi)教授鑒定為菊科甜葉菊屬植物甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertoni），新選育出的4個品系于2010年6月扦插生根后移栽于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研農(nóng)場，每個品系種植3個小區(qū)，每個小區(qū)栽種20株，株行距40cm×20cm，3次重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)藝性狀調(diào)查 于2010年8月中旬甜葉菊開花前期，每份材料分別按小區(qū)取樣，每小區(qū)隨機(jī)取樣5株長勢中等，具有代表性的植株，考察株高、中部莖節(jié)長、一級分枝數(shù)、葉長、葉寬、葉干重、莖干重等。葉形的劃分參考文獻(xiàn)[1]。

1.2.2 RA和ST糖苷測定 （1）儀器與試劑：Agilent公司1100型高效液相色譜儀（含脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動進(jìn)樣器進(jìn)樣、柱溫箱、DA D檢測器）、上海一恒科技有限公司HWS 28型電熱恒溫水浴鍋、Thermo BR4i型冷凍離心機(jī)、Sartorius CP225 D型電子天平、HS6150 D型超聲清洗器、Millipore Mill-Q型超純水系統(tǒng)等。RA苷標(biāo)準(zhǔn)品為日本和光純藥業(yè)株式會社制，其純度≥97.4%；ST苷標(biāo)準(zhǔn)品為成都曼思特對照品制，其純度≥95.5%；乙腈為色譜純；乙醇、Ca（OH）2、FeSO4·7H2O 等為分析純。

（2）糖苷提取方法：精密稱取甜葉菊粉末1g于50mL離心管中，加入蒸餾水20mL，蓋緊離心管蓋，80℃下恒溫水浴浸提2h，期間攪拌2次。8000r/min離心10min，倒出上清液備用，殘渣再加20mL蒸餾水水浴浸提 2h，期間攪拌 2 次。 8000r/min 離心 10min，合并兩次提取的上清液，按 5∶3 的比例[7]加入 Ca（OH）2和 FeSO4·7H2O，80℃下靜置沉淀2h，再8000r/min離心10min，取上清液定容至50mL，待測。3次重復(fù)。

（3）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別稱取RA苷標(biāo)準(zhǔn)品0.0510g和ST苷標(biāo)準(zhǔn)品0.0500g于50mL容量瓶中，用V乙腈︰V水=75︰25定容至刻度，再超聲5min，得RA苷和ST苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（4）色譜條件：色譜柱：Phenomenex Luna NH2 柱，4.6mm×250mm；流動相：V乙腈︰V水=75︰25；流速：1.2mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：205nm；進(jìn)樣量：10μL。

（5）方法學(xué)考察：①精密度試驗：分別精密吸取RA和ST苷標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄結(jié)果，考察儀器精密度；②穩(wěn)定性試驗：分別精密吸取RA和ST苷標(biāo)準(zhǔn)溶液及試驗樣品10μL，分別在6、12、24、48、72 h進(jìn)樣測定，在同一色譜條件下進(jìn)樣，記錄結(jié)果，考察儀器精密度；③重現(xiàn)性試驗：取同一份甜葉菊材料，按1.2.2（2）的提取方法分別同時配制6份樣液精密進(jìn)樣10μL，在同一色譜條件下進(jìn)樣，記錄結(jié)果，考察試驗方法重現(xiàn)性。

（6）樣品測定：樣品提取液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，取供試品溶液10μL，進(jìn)樣，測定峰面積，以峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算甜葉菊中RA苷和ST苷含量。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 由色譜工作站計算樣品中RA和ST糖苷含量。采用Excel軟件進(jìn)行基本數(shù)據(jù)的統(tǒng)計，采用DPS v7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差和相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品系主要農(nóng)藝性狀比較

方差分析結(jié)果表明，4個品系間除一級分枝數(shù)差異不顯著外，株高、節(jié)長、葉長、葉寬、葉長寬比、莖葉干重等農(nóng)藝性狀間均存在顯著差異。多重比較結(jié)果表明，SR-3和SR-5品系植株顯著高于SR-1和SR-2品系，中部節(jié)間長度也顯著長于SR-1和SR-2品系。從表1中還可以看出，SR-1品系平均葉長6.40cm，葉寬1.66cm，長寬比3.09，葉形為披針形；SR-2品系平均葉長7.67cm，葉寬1.38cm，長寬比5.49，SR-2為4個品系中葉片最長、最窄的品系，葉形為柳葉形；SR-3品系的葉片長寬比為4個品系中最小，平均長寬比2.97，葉形為短橢圓形；SR-5品系葉片最大，平均葉長7.27cm，葉寬2.27cm，平均葉長寬比為3.21，葉形為大披針形。4個品系中無論是干葉產(chǎn)量、莖干產(chǎn)量還是莖葉總產(chǎn)量最高的都是SR-5品系，其次是SR-3、SR-1，產(chǎn)量最低的是SR-2。

表1 不同品系甜葉菊主要農(nóng)藝性狀（Duncan法）

2.2 不同品系甜葉菊糖苷含量比較

2.2.1 方法學(xué)考察結(jié)果 （1）精密度試驗：分別精密吸取RA和ST苷標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測得RA和ST苷相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD）分別為1.05%、1.37%，表明儀器進(jìn)樣精密度良好。（2）穩(wěn)定性試驗：分別精密吸取RA和ST苷標(biāo)準(zhǔn)溶液及試驗樣品10μL，分別在6、12、24、48、72 h進(jìn)樣測定，標(biāo)準(zhǔn)品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.14%、1.36%；樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.18%。結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)品及樣品在72 h內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。（3）重現(xiàn)性試驗：取同一份甜葉菊材料6份提取液，精密進(jìn)樣10μL，測得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均為2.45%，表明該方法的重現(xiàn)性較好。

2.2.2 不同品系糖苷含量 4個甜葉菊品系在糖苷品質(zhì)上存在明顯差異，其RA苷、ST苷、總苷（RA＋ST）含量及RA/ST比值等差異顯著，4個品系間各指標(biāo)測定結(jié)果見表2。從表中可以看出，4個品系的RA苷含量從高到低依次為SR-2＞SR-3＞SR-1＞SR-5，RA苷含量最高的品系是SR-2，其RA苷含量達(dá)11.59%；其次為SR-3，含量為8.70%；RA苷含量最低的品系是SR-5，RA苷含量僅為2.16%。4個品系的ST苷含量從高到低依次為SR-5＞SR-1＞SR-2＞SR-3，SR-5 和SR-1的ST苷含量分別高達(dá)17.39%和15.26%，ST苷含量最低的是SR-3品系，含量為6.93%?？傑蘸浚≧A＋ST）從高到低依次為 SR-1＞SR-2＞SR-5＞SR-3， SR-3 品系可能是因生成較高的RC苷的緣故，總苷含量為4個品系中最低。4個品系中RA苷占總苷（RA＋ST）比例最高的是SR-2品系，其次是SR-3，分別占55.96%，55.68%。4個品系中ST苷占總苷（RA＋ST）比例最高的是SR-5品系，高達(dá)88.94%。RA/ST值SR-3品系與SR-2品系接近，但SR-2的RA糖苷、ST糖苷含量均顯著高于SR-3。

表2 不同品系甜葉菊糖苷含量（Duncan法）

4個品系的甜葉菊糖苷測定的HPLC色譜圖有明顯區(qū)別，見圖 1～4。結(jié)合圖 1～4和表2中RA苷、ST苷含量及RA/ST比值可以看出，SR-1為高ST型甜葉菊品系，SR-2為高RA型品系，SR-3為高RC型品系，SR-5為高ST低RA型甜菊品系。

圖1 SR-1品系HPLC圖

圖2 SR-2品系 HPLC圖

圖3 SR-3品系HPLC圖

圖4 SR-5品系HPLC圖

圖5 RA苷標(biāo)品HPLC圖

圖6 ST苷標(biāo)品HPLC圖

2.3 各性狀間的相關(guān)性

由表3可以看出，產(chǎn)量指標(biāo)與株高、節(jié)長、一級分枝數(shù)、葉寬等農(nóng)藝性狀呈正相關(guān)關(guān)系，其中干葉產(chǎn)量與株高、節(jié)長、葉寬相關(guān)顯著；莖干重與節(jié)長、干葉重呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別高達(dá)0.98、0.96。甜葉菊的品質(zhì)指標(biāo)ST糖苷、總苷及RA/ST比值等指標(biāo)與農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量指標(biāo)間相關(guān)程度低或不相關(guān)；RA糖苷含量與產(chǎn)量指標(biāo)間呈顯著負(fù)相關(guān)，同葉干重、莖干重、莖葉干重間相關(guān)系數(shù)分別為-0.94，-0.90，-0.93，說明高RA苷含量甜菊品系，其產(chǎn)量往往會偏低；ST苷含量則與各農(nóng)藝性狀間相關(guān)均不顯著；總苷含量除與一級分枝數(shù)間呈顯著負(fù)相關(guān)外，與其他農(nóng)藝性狀間相關(guān)均不顯著；RA/ST比值盡管與葉干重、莖干重、莖葉干重間相關(guān)系數(shù)值較高，分別為-0.73，-0.69，-0.72，但均未達(dá)顯著水平；此外，RA苷與ST苷間呈較高的負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為-0.84，RA苷與ST苷間表現(xiàn)出此消彼長的趨勢，但也未達(dá)顯著水平。由此說明，盡管提高甜菊的產(chǎn)量會一定程度影響甜葉菊的品質(zhì)，但仍有可能選出既高產(chǎn)，品質(zhì)又符合生產(chǎn)所需的優(yōu)良甜葉菊新品種。

表3 各性狀間相關(guān)系數(shù)

3 討論

一般認(rèn)為ST苷和RA苷性狀連鎖，難以同時提高二者含量；同時提高產(chǎn)量和品質(zhì)也是較為困難的[1－8]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA苷與ST苷間存在此消彼長的趨勢，但未達(dá)顯著水平。同時，盡管RA苷含量與產(chǎn)量指標(biāo)間呈顯著負(fù)相關(guān)，ST苷卻與各農(nóng)藝性狀間相關(guān)均不顯著；總苷含量除與一級分枝數(shù)間呈顯著負(fù)相關(guān)外，與其他農(nóng)藝性狀間相關(guān)也均不顯著。據(jù)此認(rèn)為，雖然提高甜菊的產(chǎn)量會一定程度影響甜葉菊的品質(zhì)，但仍有可能選出既高產(chǎn)，品質(zhì)又符合生產(chǎn)所需的優(yōu)良甜葉菊新品種。舒世珍等[9]的研究表明，甜葉菊的葉長、葉寬與總苷量有顯著正相關(guān)關(guān)系，本研究結(jié)果與其不盡一致。究其原因，可能是材料不同所致。單株干葉產(chǎn)量與株高、中部莖節(jié)長及葉片寬度等相關(guān)顯著，但一些對植株干葉產(chǎn)量可能構(gòu)成影響的因子，如莖粗、總分枝數(shù)、單株葉片數(shù)等，本文尚未考察到。另外該試驗所測產(chǎn)量比其他文獻(xiàn)報道[9－11]相比偏低，其主要原因為所用材料是今年6月扦插苗，生育期偏短所致。為此，明年我們將進(jìn)行進(jìn)一步試驗驗證。

由于甜葉菊中RA苷甜度更高、甜味更佳，目前甜葉菊栽培上的主推品種大多為高RA含量的糖用型甜葉菊品種，而近年來的文獻(xiàn)表明ST苷具有降低Ⅱ型糖尿病血糖濃度和控制高血壓的作用[3－4]，并且ST苷還具有很好的抗癌活性[5]，有望開發(fā)成為新一代天然抗癌制劑，這使得選育高ST含量的藥用型甜葉菊品種具有一定的前景。過去的甜葉菊糖用品種曾主要是高ST型品種，但ST苷含量一般在60%～80%[9]，新選育的SR-5品系為高ST低RA型品系，具有高ST/RA值、更高ST苷含量（ST＞88%）等特點(diǎn)，對于工業(yè)生產(chǎn)上ST苷的提取極為有利，且SR-5品系在4個品系中莖葉產(chǎn)量最高，可能是一個較好的生產(chǎn)藥用ST苷的甜葉菊品系。而對于糖用型甜葉菊品種，要求其含有較高的RA苷含量和高RA/ST值，SR-2品系和SR-3品系都具有高RA/ST值的特性，雖然綜合產(chǎn)量因素考慮，SR-3品系的RA苷產(chǎn)量更高，但由于SR-3中還有較高的RC苷含量，RC苷甜度低，生產(chǎn)中不希望摻雜此類成分，高RC苷含量無疑將繁化工藝程序，增加生產(chǎn)成本；而SR-2品系的RA苷含量較SR-3品系更高，雖然莖葉產(chǎn)量偏低，但通過進(jìn)一步地從SR-2品系中優(yōu)選長勢繁茂的單株及良好的栽培管理等措施，SR-2品系更可能成為高RA苷糖用型甜葉菊育種的良好材料。

4個甜葉菊品系無論是在植株外觀形態(tài)、莖葉產(chǎn)量還是糖苷品質(zhì)上均存在顯著差異，說明4個品系具有較為穩(wěn)定的外部形態(tài)特征和生理特征，使將這4個品系進(jìn)一步選育成不同品種成為可能。

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