李 彬，吳海山，溫 昱

(1中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院，沈陽110004;2上海長征醫(yī)院;3中國醫(yī)科大學組胚教研室)

前交叉韌帶(ACL)不僅是膝關節(jié)的被動穩(wěn)定裝置，對于膝關節(jié)正常本體感覺維持亦起重要作用［1，2］。ACL損傷后力學強度下降，但殘存韌帶結(jié)構(gòu)仍連接著股骨和脛骨，從而使韌帶內(nèi)保留的本體感受器可繼續(xù)受到機械刺激，這種狀況下ACL是否可以發(fā)揮本體感覺功能及其隨時間的變化少見報道。2008年6～12月，我們觀察了不同時間段ACL損傷后殘存韌帶內(nèi)本體感受器形態(tài)和功能變化，并探討其可能機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康新西蘭大白兔12只，雌雄不限，體質(zhì)量1 500～2 000 g。氯化金、88%甲酸、100%甘油、石蠟螺旋切片機、數(shù)碼照相機(COOLPIX 4500)、日本光電MEB-2200誘發(fā)電位儀。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 12只兔均取一側(cè)膝關節(jié)制備ACL損傷模型(模型組):3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈給藥麻醉，采用膝關節(jié)髕旁內(nèi)側(cè)入路切開，顯露前交叉韌帶，將韌帶切斷3/4，只余1/4連接，逐層間斷縫合切口，敷料包扎。另一側(cè)不做手術作為正常側(cè)(對照組)。術畢單只籠內(nèi)喂養(yǎng)。切口換藥前后均肌注青霉素10萬U預防感染，術后2、4、6個月分別取4只兔行電生理學檢查，之后分別采用耳緣靜脈推注空氣栓塞法處死實驗動物，進行本體感受器觀察。

1.2.2 電生理學指標檢測 將家兔用乙醚吸入麻醉結(jié)合1%利多卡因局部麻醉，麻醉成功后固定頭部及四肢，采用膝關節(jié)內(nèi)側(cè)髕旁入路切開并顯露ACL。兩眶后緣連線與正中矢狀線交點后0.5 cm并旁開0.2 cm作為記錄電極點，皮層參考電極放置于鼻根部皮下，后肢近端用皮下電極接地測定體感誘發(fā)電位(SEPs)。而后將記錄電極置于腘繩肌肌腹，參考電極放置于內(nèi)踝部行肌電圖(EMG)檢查。用雙極表面電極刺激前交叉韌帶偏兩極骨附著部位，刺激強度18～20 V。采用日本光電MEB-2200誘發(fā)電位儀記錄SEPs和EMG，信號輸入微機操作系統(tǒng)，分析SEPs和EMG圖形、潛伏期和波幅。

1.2.3 本體感受器結(jié)構(gòu)及數(shù)量觀察 實驗動物處死后將ACL的股骨和脛骨附著點切斷后完整取出，采用改良氯化金染色方法進行染色［3］，具體過程:置于新鮮檸檬汁和88%甲酸的混合液中(檸檬汁∶88%甲酸=3∶1)，而后暗室中室溫下放置15min;取出標本，用濾紙吸干表面殘余液體，將其放入1%氯化金溶液中，于暗室中室溫放置30 min;取出標本，用濾紙吸干表面殘余氯化金溶液，放入25%甲酸溶液，暗室中室溫下放置15 h。蒸餾水沖洗標本至少1 h后放入純甘油中保存24 h以上;常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋，制成15μm厚切片，光學顯微鏡觀察。每個ACL標本石蠟塊固定于螺旋切片機上進行連續(xù)切片，石蠟切片條帶按順序擺放，分清韌帶的股骨附著端、中間部和脛骨附著端，利用本體感受器周圍韌帶組織的特征性結(jié)構(gòu)進行分辨，計數(shù)本體感受器。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，組間比較采用方差檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 電生理學指標 見表1。

表1 兩組SEPs及EMG潛伏期和波幅變化(±s)

表1 兩組SEPs及EMG潛伏期和波幅變化(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

檢測指標 模型組2個月 4個月 6個月 對照組SEPs潛伏期(ms)17.6 ±7.9 20.3 ±9.4 22.4 ±10.1 14.3 ±4.7*波幅(μV) 11.4 ±6.3 6.6 ±2.1 5.9 ± 1.9 21.0 ±4.9*EMG潛伏期(ms)12.0 ±3.8 15.0 ±6.7 16.0 ± 7.1 6.1 ±1.2*波幅(mV) 0.3 ±0.04 0.2 ±0.03 0.2 ± 0.01 0.5 ±0.08*

2.2 本體感受器結(jié)構(gòu)及數(shù)量 光學顯微鏡下對照組可觀察到4種類型神經(jīng)末梢:Ruffini小體、Pacinian小體、Golgi類健體和游離神經(jīng)末梢。Ruffini小體呈樹狀外觀，具有主干、枝干和葉狀結(jié)構(gòu);Pacinian小體呈橢圓形和圓筒狀外觀，外周是一層厚板層狀的背囊;Golgi類腱體體積最大，呈螺旋狀外觀;游離的神經(jīng)末梢是無髓神經(jīng)纖維，形狀無一定規(guī)律。其中游離神經(jīng)末梢和Ruffini小體數(shù)量最多。所有的神經(jīng)末梢結(jié)構(gòu)主要分布于韌帶的骨端(主要是股骨端)附著點附近。觀察組損傷后2、4、6個月韌帶內(nèi)典型結(jié)構(gòu)的感受器逐漸減少，非典型的感受器結(jié)構(gòu)數(shù)量增多，其中Ruffini小體體積減小，樹狀結(jié)構(gòu)中的葉狀結(jié)構(gòu)減少，Pacinian小體體積減小，被囊變薄甚至有部分的缺損，總的神經(jīng)感受器結(jié)構(gòu)(包括典型和非典型)數(shù)量明顯減少。

3 討論

以往多數(shù)學者認為韌帶只是被動發(fā)揮穩(wěn)定關節(jié)的作用，隨著研究的深入，逐漸認識到韌帶內(nèi)本體感受器對于維持關節(jié)的正常功能必不可少。1944年Gardner［4］在貓膝關節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶中發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)，但未對ACL進行此類研究。Schultz等［5］在1984年對人體ACL采用氯化金染色方法觀察并描述了神經(jīng)末梢的結(jié)構(gòu)，此后關于ACL的生物力學和神經(jīng)生理特性的研究廣泛開展。Freeman等［6］改良氯化金染色方法后對人體ACL進行觀察并記錄了四種神經(jīng)末梢結(jié)構(gòu):Ruffini小體、Pacinian小體、Golgi類腱體和游離神經(jīng)纖維，在此基礎上其特別提出ACL承擔的神經(jīng)生理方面功能與其生物力學作用同樣重要。隨后越來越多的研究證實，ACL的本體感覺功能與膝關節(jié)的功能密切相關，ACL損傷后不但導致膝關節(jié)不穩(wěn)，其承擔的本體感覺作用削弱亦是膝關節(jié)功能下降的重要原因［1，2］。關節(jié)內(nèi)韌帶本體感受器的結(jié)構(gòu)及功能對判定關節(jié)功能及是否保留感受器至關重要。

ACL嚴重損傷患者需要手術治療進行重建以恢復膝關節(jié)的穩(wěn)定是目前關節(jié)外科的共識，但對于部分損傷僅存在操作檢查輕度異常而無明顯癥狀和體征患者的治療，存在兩種不同治療意見:傳統(tǒng)的治療方法證實通過合適的保守治療措施可使膝關節(jié)基本功能恢復;而近年來多數(shù)學者認為，ACL損傷必然會削弱膝關節(jié)的穩(wěn)定性，這種客觀的關節(jié)不穩(wěn)將導致關節(jié)的提前退變，因而建議對ACL損傷重建持積極態(tài)度。臨床研究證實康復治療不但有助于提高膝關節(jié)的穩(wěn)定性，而且可明顯改善本體感覺狀態(tài)［1，2］。對損傷ACL本體感覺作用的研究有助于更科學地指導損傷膝關節(jié)的康復治療，對行ACL重建的患者亦可明確殘存韌帶的去留問題。Adachi等［7］對ACL損傷的患者進行關節(jié)鏡操作時病檢殘存的ACL組織，發(fā)現(xiàn)術前患膝位置覺測定結(jié)果與術中發(fā)現(xiàn)的殘存組織的機械受體數(shù)量明顯相關，說明ACL在膝關節(jié)的本體感覺中起重要作用，但其未說明這些韌帶損傷的時間，亦未提供殘存的ACL內(nèi)本體感受器形態(tài)變化。

對人體膝關節(jié)本體感覺的測試方法很多，但用于實驗動物的方法較少，SEPs和EMG是目前公認可以用于檢查實驗動物膝關節(jié)本體感覺狀態(tài)的方法［8，9］，尤其腘繩肌收縮潛伏期在 ACL損傷后常顯著延長，與膝關節(jié)的功能性不穩(wěn)直接相關，可作為ACL受損后本體感覺的客觀指標。本研究結(jié)果顯示，觀察組隨損傷時間延長SEPs和EMG的潛伏期逐漸增加，波幅逐漸降低，說明損傷韌帶內(nèi)神經(jīng)纖維在維護膝關節(jié)正常本體感覺方面的作用逐漸減弱。觀察組隨損傷時間延長韌帶內(nèi)神經(jīng)纖維數(shù)量逐漸減少，本體感受器的形態(tài)發(fā)生改變，異形的本體感受器增多，體積縮小，部分結(jié)構(gòu)缺失。說明ACL損傷后韌帶內(nèi)的本體感受器短期內(nèi)仍能發(fā)揮一定作用，但隨損傷時間延長，其作用逐漸減弱。機制可能與韌帶損傷后強度下降，逐漸松弛，從而使韌帶內(nèi)神經(jīng)結(jié)構(gòu)在膝關節(jié)活動的過程中不能受到應有的力學刺激有關。

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