朱鳳池 戚 峰 鞏發(fā)才 季 兵 劉 彤

區(qū)域性淋巴轉移是大腸癌最常見的轉移途徑，伴有淋巴結轉移的大腸癌患者5年生存率遠低于無淋巴結轉移者[1]。多種因素影響大腸癌淋巴結轉移過程，其中血管內皮生長因子（VEGF）-C具有重要作用，低氧誘導因子（HIF-1）、信號轉導和轉錄活化因子（STAT3）可作為啟動子的主要轉錄因子誘導VEGF。本研究旨在探討HIF-1α和STAT3在大腸癌淋巴轉移中的作用，為尋找新的大腸癌分子靶點提供理論參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集我院2008年4月—2009年3月經病理證實為大腸癌的標本60例，男32例，女28例，年齡43～80歲，平均年齡（67±2）歲，術前均未進行任何治療。腺癌52例，黏液腺癌8例；高分化15例，中分化33例，低分化12例。浸潤深度：T1+T2 4例，T3 47例，T4 9例；淋巴結轉移31例；Dukes分期：A+B期29例，C期22例，D期9例。每例標本均采集大腸癌組織（T組）和遠癌切端腸組織黏膜（N組），采集標本分別于-80℃冷凍保存和浸泡于10%福爾馬林備用。

1.2 方法

1.2.1 目標基因mRNA水平檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測HIF-1α、STAT3和VEGF-C的基因轉錄，包括提取細胞總RNA并純化，合成cDNA第一鏈，利用PCR方法擴增模板cDNA，回收DNA片段制作標準曲線。根據標準曲線標本中各自的拷貝數，用GAPDH作為內參對HIF-1α、STAT3和VEGF-C進行校正。每個樣本標本均重復測量3次，取其平均值。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.2 目標基因蛋白表達水平檢測 取標本石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，于pH 6.0枸櫞酸鹽緩沖液中微波加熱作抗原修復，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，進行免疫組化檢測。采用免疫組化鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物法（SABC法）分別檢測HIF-1α、STAT3和VEGF-C的蛋白表達水平，一抗分別為兔抗人的HIF-1α、STAT3及VEGF-C多克隆抗體。

1.2.3 免疫組化結果判斷 HIF-1α和VEGF-C結果參考Zhong等[2]的方法，HIF-1α陽性細胞數<1%為陰性，陽性細胞數≥1%為陽性。VEGF-C陽性細胞數<25%為陰性，陽性細胞數≥25%定為陽性。STAT3結果判定參照Saito等[3]綜合計分法，0～2分為陰性，≥3分為陽性。

1.2.4 淋巴管密度（LVD）計算 以小鼠抗人podoplanin單克隆抗體標記大腸癌微淋巴管，檢測微淋巴管密度。按照Wei?dner等[4]報道的方法，先在低倍鏡（×40）下掃視整個視野的腫瘤區(qū)域，選擇其中的4個淋巴管密集區(qū)，然后在高倍鏡（×200）下計數微淋巴管數，取其平均值作為該例標本的LVD值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件包進行數據分析處理，計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料采用卡方檢驗，相關性采用Spearman秩相關檢驗和R×C表分類資料的關聯性分析，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 HIF-1α、STAT3和VEGF-C表達與遠癌切端及淋巴結轉移的比較 T組中HIF-1α、STAT3和VEGF-C分子的mRNA轉錄水平及蛋白表達陽性比例高于N組，淋巴結轉移患者HIF-1α、STAT3和VEGF-C分子表達高于無淋巴結轉移患者，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2、圖1。

表2 HIF-1α、STAT3和VEGF-C分子表達與遠癌切端及淋巴結轉移的關系

2.2HIF-1α、STAT3與VEGF-C的mRNA表達相關性 HIF-1α和STAT3與VEGF-C mRNA轉錄水平均呈正相關（rs分別為0.873和0.982，均P<0.05）。

2.3 HIF-1α、STAT3與VEGF-C的蛋白表達相關性 HIF-1α和STAT3陽性組的VEGF-C表達明顯高于陰性組的表達，呈正相關（均P<0.05），見表3。

表3 HIF-1α、STAT3與VEGF-C蛋白表達水平的關系

2.4 有無淋巴結轉移患者LVD比較 淋巴結轉移患者LVD為19.81±7.36，高于無淋巴結轉移患者的15.49±5.76，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.521，P<0.05）。

3 討論

淋巴結轉移是大腸癌常見的轉移途徑，本實驗研究了在大腸癌淋巴結轉移中起重要作用的HIF-1α、STAT3和VEGF-C分子。Royston等[5]認為，VEGF-C的過度表達增加了腫瘤內及腫瘤邊緣淋巴管的表面積，利于癌細胞轉移。隨著原發(fā)腫物的發(fā)展，淋巴管截面平均面積增多，促使癌細胞更容易進入淋巴管而轉移，提示淋巴管新生在大腸癌轉移起重要作用。因此，VEGF-C在大腸癌癌變過程中起一定的促進作用。

淋巴管生成可發(fā)生在炎癥、腫瘤等的病理過程。Gao等[6]研究發(fā)現，淋巴管生成是主動介導腫瘤轉移的。腫瘤早期常發(fā)生淋巴結轉移，提示淋巴管在腫瘤轉移過程中起重要作用。本研究顯示，大腸癌組織淋巴結陽性標本中LVD明顯升高，提示微淋巴管生成與大腸癌淋巴結轉移密切相關。

HIF-1α是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物及人體的一種轉錄因子。惡性腫瘤生長過程，由于組織增生過快造成局部嚴重缺氧和供能與耗能之間不平衡。HIF-1α能通過誘導VEGF-C和糖酵解相關酶的表達，增加供血、供能，表明HIF-1α與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。本研究亦顯示，HIF-1α與VEGF-C的表達存在正相關性，提示腫瘤迅速增殖引起組織缺血缺氧，誘導HIF-1α的表達，促進腫瘤淋巴管的生成。

STAT3是EGFR、IL26/JAK、Src等多個致癌性酪氨酸激酶信號通道匯聚的焦點，在多種腫瘤細胞中均發(fā)現持續(xù)性過度激活。STAT3的表達可以調控該轉錄因子參與的多種異常的腫瘤信號途徑：如抗凋亡基因Bcl-xl、Bcl-2，細胞周期控制基因C-fos等的表達，從而誘導腫瘤細胞增殖，阻斷細胞凋亡[7]。因此，STAT3基因被公認為是重要的癌基因之一。Niu等[8]研究發(fā)現STAT3可以直接結合VEGF基因的啟動子，從而調控VEGF的表達。本研究發(fā)現，STAT3與VEGF-C的表達存在相關性。因此，阻斷STAT3信號通路可以阻斷有多種信號途徑介導的腫瘤淋巴管生成，阻止腫瘤的生長和轉移。STAT3是一個抑制腫瘤VEGF表達和淋巴管生成的有效靶點。

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