門秀麗 趙利軍 孔小燕 趙 霞 李克寧 張連元

胰島β細胞功能紊亂是糖尿病的主要發(fā)生機制之一[1]。β細胞的抗氧化酶水平較機體其他組織細胞低，極易受到氧化因子的攻擊[2]。線粒體是細胞活性氧（ROS）的主要來源，同時也是ROS損傷作用的主要靶點[3]。ROS可引起胰島β細胞胰島素啟動因子胰十二指腸同源盒基因1（pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1）表達下調(diào)。研究表明，高血糖所致氧化應激可導致胰腺組織PDX-1表達下調(diào)[3]。葛根素和牛磺酸均具有一定的降血糖、抗自由基作用[4]。本研究旨在探討葛根素聯(lián)合?；撬釋?型糖尿病大鼠胰腺的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）動物：健康雄性Wistar大鼠（SPF級）50只，2個月齡，體質(zhì)量180～240 g，購自北京醫(yī)科大學實驗動物中心。實驗期間動物自由飲水，攝食飼料為華北煤炭醫(yī)學院實驗動物中心提供的混合飼料（碳水化合物占總熱量的66.5%、脂肪占10.2%、蛋白占23.3%），適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。室溫18℃～28℃，相對濕度62%～80%。（2）主要儀器與試劑：鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自Sigma公司;胰島素酶聯(lián)免疫試劑盒購自美國Linco公司;糖化血紅蛋白（HbA1c）檢測采用挪威Axis-Shield（NycoCard ReaderⅡ）檢測儀，葡萄糖（Glucose）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、ROS及總蛋白定量試劑盒購自南京建成生物工程研究所，?；撬岱蹌┵徸灾袊萆锘瘜W有限公司（批號:980018），葛根素注射液購自海南斯達制藥有限公司（批號：H20023176）。PDX-1羊抗大鼠抗體購自Santa Cruz公司，抗羊二抗購自唐山灝洋生物制品公司。SIGMA-2M/ETM低溫高速離心機購自美國Sigma公司；FSH-Ⅱ高速電動勻漿器購自江蘇金壇國勝實驗儀器廠；Salzburg酶標儀，721分光光度計購自上海第三分析儀器廠。

1.2 模型制備與分組 50只大鼠給以高糖高脂飼料，持續(xù)喂養(yǎng)4周后，尾靜脈一次性注射STZ溶液25 mg/kg，72 h后測空腹血糖，以血糖值11.1～33.3 mmol/L為造模成功，共40只，按隨機數(shù)字表隨機分為糖尿?。―M）組、?；撬嶂委煟═au）組、葛根素治療（Pue）組和葛根素聯(lián)合?；撬嶂委煟≒ue+Tau）組，每組10只。Tau組大鼠腹腔注射質(zhì)量濃度為20 g/L?；撬嵘睇}水溶液，200 mg（/kg·d），Pue組大鼠腹腔注射葛根素注射液160 mg（/kg·d），Tau+Pue組大鼠腹腔先后注射等量的葛根素和?；撬?，DM組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水溶液，持續(xù)8周。

1.3 觀察指標 末次給藥后，4組大鼠均禁食12 h尾靜脈取血測定HbA1c，從腹主動脈取血5 mL，2 000 r/min離心15 min 取血漿，按試劑盒說明書測Glucose、SOD、MDA、ROS和胰島素（Insulin）水平。

1.4 胰腺組織處理及指標測定 取血后，每組取6只大鼠剖腹分離出胰腺，沖洗，拭干，分離去脂肪，稱質(zhì)量。用冷生理鹽水溶液制成100 g/L的組織勻漿，2 000 r/min離心10 min取上清液，再以11 000 r/min低溫高速離心20 min，沉淀，用冰冷生理鹽水溶液制成線粒體混懸液，線粒體在光學顯微鏡下觀察呈細沙樣，用超聲細胞粉碎儀將線粒體破碎，按試劑盒說明進行MDA、SOD及ROS測定。蛋白定量采用考馬斯亮藍法。

1.5 胰腺組織的免疫組織化學染色 處死大鼠即刻取胰尾部分進行PDX-1的免疫組織化學染色，光學顯微鏡下觀察并照相。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 10.0軟件進行分析，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較用單因素方差分析,組間比較采用LSD-t法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血漿Glucose、Insulin及SOD等比較 Tau組、Pue組及Pue+Tau組較DM組大鼠血漿SOD活性和血漿胰島素水平均有顯著升高，而Glucose、MDA、ROS及HbA1c呈不同程度的降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

表1 各組血漿葡萄糖、胰島素及SOD等指標比較±s）

表1 各組血漿葡萄糖、胰島素及SOD等指標比較±s）

*P<0.05，**P<0.01；表2同

DM組（1）Tau組（2）Pue組（3）Pue+Tau組（4）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（4）（3）∶（4）10 10 10 10 Glucose（mmol/L）24.13±5.27 17.61±3.56 16.73±4.35 12.37±1.78 106.23**0.007 0.005 0.002 0.040 0.031 Insulin（μg/L）1.07±0.12 2.21±0.33 2.58±0.51 3.68±0.49 55.33**0.008 0.006 0.040 0.030 0.040 SOD（U/L）18.38±3.33 24.35±6.37 23.12±5.94 29.51±5.17 148.56**0.030 0.040 0.006 0.040 0.040 MDA（nmol/L）6.35±0.78 5.42±1.64 4.38±0.91 3.49±0.37 61.82**0.040 0.031 0.007 0.040 0.071 ROS（U/mL）39.23±5.78 23.38±6.67 22.14±4.39 16.92±2.26 341.27**0.030 0.030 0.002 0.030 0.040 HbA1c（%）8.30±2.21 6.11±1.98 6.92±2.02 5.31±1.56 91.11**0.031 0.042 0.007 0.060 0.041 DM組（1）Tau組（2）Pue組（3）Pue+Tau組（4）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（4）（3）∶（4）10 10 10 10組別 n組別 n

2.2 各組胰腺線粒體MDA、SOD和ROS水平的比較 Tau組、Pue組及Pue+Tau組大鼠胰腺線粒體MDA和ROS水平較DM組均有不同程度的降低，而SOD活性均有顯著升高，其中Pue+Tau組這種變化更加明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），見表2。

2.3 各組胰腺組織PDX-1免疫組織化學染色結(jié)果 PDX-1免疫組化陽性細胞主要位于胰腺的胰島細胞內(nèi)，外分泌腺細胞未見表達，DM組大鼠胰島細胞中PDX-1表達水平較低，Tau和Pue組胰島細胞PDX-1表達上調(diào)，Pue+Tau組PDX-1表達明顯上調(diào)，見圖1～4。

表2 各組動物胰腺組織線粒體MDA、SOD和ROS比較 ±s）

表2 各組動物胰腺組織線粒體MDA、SOD和ROS比較 ±s）

組別DM組（1）Tau組（2）Pue組（3）Pue+Tau組（4）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（4）（3）∶（4）n6666 MDA（μmol/g）4.31±0.29 2.83±0.14 3.13±0.27 1.78±0.29 86.13**0.003 0.040 0.002 0.041 0.008 SOD（U/mg）0.06±0.01 0.12±0.02 0.15±0.04 0.18±0.03 35.72**0.002 0.008 0.001 0.030 0.040 ROS（U/mL）57.37±7.21 41.53±6.08 44.69±8.97 35.43±5.81 749.28**0.007 0.030 0.002 0.041 0.032

3 討論

線粒體是細胞進行生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的主要場所，其不僅是ROS的主要來源，同時也是ROS損傷作用的主要靶點[5]。ROS可引起胰島β細胞胰島素啟動因子PDX-1表達下調(diào)。研究表明，高血糖所致氧化應激會導致胰島素啟動子蛋白PDX-1的缺失，從而引起胰島素基因表達下調(diào)，使胰島素的分泌減少、β細胞功能衰退，進一步加重了糖脂代謝紊亂；而PDX-1主要在胰島的β細胞中表達，其對胰腺的發(fā)育成熟及胰島素基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控起重要作用[3]。

本研究顯示，與DM組大鼠相比較，Pue+Tau組大鼠胰腺組織中ROS和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平明顯降低，抗氧化酶SOD活性增強，同時觀察到血漿胰島素水平增加，而血糖和糖化血紅蛋白水平降低，表明葛根素聯(lián)合?；撬峥赏ㄟ^增強糖尿病大鼠胰島組織抗氧化酶的活性，加大對自由基的清除，減輕大量自由基對胰島β細胞的過氧化損傷，保護了胰島β細胞的功能。另外，糖尿病模型組大鼠胰腺PDX-1蛋白表達較弱，說明長期高血糖可以使PDX-1表達下降，并使其對于葡萄糖的反應性減弱，導致胰島素的分泌減少。而葛根素聯(lián)合?；撬岣深A可明顯上調(diào)胰島β細胞PDX-1蛋白的表達，從而促進胰島素的分泌，保護胰島細胞的功能。結(jié)合前面的實驗結(jié)果，筆者認為葛根素聯(lián)合?；撬峥赏ㄟ^減輕2型糖尿病時的氧化應激反應上調(diào)PDX-1蛋白的表達，實現(xiàn)對糖尿病胰島β細胞的保護作用。

[1]Kavaler S，Morinaga H，Jih A，et al.Pancreatic{beta}-cell failure in obese mice with human-like CMP-Neu5Ac hydroxylase deficiency[J].FASEB J，2011，25(6):1887-1893.

[2]Drews G，Krippeit-Drews P，Düfer M.Oxidative stress and be?ta-cell dysfunction[J].Pflugers Arch，2010，460(4):703-718.

[3]Robertson R，Zhou H，Zhang T，et al.Chronic oxidative stress as a mechanism for glucose toxicity of the beta cell in type 2 diabetes[J].Cell Biochem Biophys，2007，48(2-3):139-146.

[4]張艷敏，趙利軍，孔小燕，等.?；撬崧?lián)合葛根素對2型糖尿病大鼠血液流變學的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2010,20（14）:2115-2117.

[5]Li N，F(xiàn)rigerio F，Maechler P.The sensitivity of pancreatic be?ta-cells to mitochondrial injuries triggered by lipotoxicity and oxi?dative stress[J].Biochem Soc Trans，2008，36(Pt 5):930-934.