程愛娟 毛用敏 崔讓莊 吳尚勤 孫 姍

腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCAl）是細(xì)胞膜上一種重要膽固醇流出調(diào)節(jié)蛋白（Cholesterol effuse regulatory protein，CERP），其介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)（Reverse cholesterol transportation，RCT）的起始環(huán)節(jié)，ABCAl正常表達(dá)可提高循環(huán)高密度脂蛋白（HDL）水平[1]，因此ABCAl表達(dá)水平對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)外的膽固醇平衡、調(diào)節(jié)血脂以及防止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生可能具有重要意義。文獻(xiàn)報(bào)道，ABCA1基因突變可導(dǎo)致個(gè)體HDL膽固醇（HDL-C）嚴(yán)重缺乏而引發(fā)冠心病[2]。本研究針對(duì)ABCA1基因啟動(dòng)子-14 bp位點(diǎn)基因多態(tài)性與冠心病發(fā)生及血脂水平的關(guān)系進(jìn)行探討。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2007年9月—2008年5月我院心臟科住院患者428例，均為長(zhǎng)期居住天津市、相互無(wú)親緣關(guān)系者。冠心病組228例，其中男122例，女106例，均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病分會(huì)提出的冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)?；颊呔?jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)主要1支血管狹窄≥50%；對(duì)照組200例，其中男113例，女87例，經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影排除冠心病。2組臨床資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性，見表1。

1.2 方法 晨起抽取肘正中靜脈血5 mL，EDTA抗凝，低滲溶血法提取DNA。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增引物：引物參照文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程公司合成，引物序列為：上游5′-GAC TGA ACT ACA TAA ACA GAG G-3′，下游5′-CGG CCC CAC TCA CTC TCG-3′。PCR擴(kuò)增體系及參數(shù)：25 μL反應(yīng)體系中各物質(zhì)的濃度為60 mmol/L Tris-HCl,pH 9.0，15 mmol/L（NH4）2SO4，3.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，0.4 μmol/L上游和下游引物，1 U Taq DNA聚合酶，0.5 μg DNA。PCR反應(yīng)條件：95℃5 min變性，后接35個(gè)循環(huán)。95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃ 延伸1 min，最后72℃延伸7 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，在2%瓊脂糖凝膠上鑒定PCR反應(yīng)結(jié)果。用限制性內(nèi)切酶Bme13901酶切PCR產(chǎn)物，反應(yīng)條件為10×Buffer 1.5 μL，Bme13901 8 U，PCR產(chǎn)物11 μL，H2O補(bǔ)足體積至15 μL，37℃孵育16 h，酶切反應(yīng)液在3.5%瓊脂糖凝膠行電泳，電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。血總膽固醇（TC）和三酰甘油（TG）用酶法測(cè)定，血HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇（LDH-C）用直接一步法測(cè)定。

表1 冠心病組和對(duì)照組臨床資料比較

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間基因型及等位基因頻率的差別用χ2檢驗(yàn)，組間及組內(nèi)血脂水平比較用t檢驗(yàn)，2組等位基因分布進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定 ABCA1啟動(dòng)子-14 bp C→T置換基因型PCR產(chǎn)物經(jīng)Bme13901酶切，瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)3種基因型，野生型CC純合子存在Bme13901的酶切位點(diǎn)（CCGG）可被酶切，出現(xiàn)91 bp和41 bp電泳條帶，變異型TT因-14 bp位點(diǎn)發(fā)生C→T置換酶切位點(diǎn)消失，因此出現(xiàn)132 bp電泳條帶，CT雜合子出現(xiàn)132、91、41 bp共3條電泳條帶。41 bp條帶片段較小，不易看清，見圖1。

2.2 2組血脂水平的比較 冠心病組TC、TG、LDL-C水平均高于對(duì)照組，而HDL-C水平則低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 2組血脂水平比較 （mmol/L ±s）

表2 2組血脂水平比較 （mmol/L ±s）

*P<0.05

冠心病組對(duì)照組t 228 200 TC 5.96±0.73 5.18±0.42 4.937*TG 2.35±0.48 1.26±0.32 2.562*HDL-C 0.54±0.13 0.95±0.22 2.337*LDL-C 2.98±0.32 2.07±0.61 3.865*組別 n

2.3 2組基因型及等位基因頻率分布 2組基因型和等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（χ2=0.071，P>0.05）。全部檢測(cè)人群中CC型占42.99%（184/428），CT型占51.64%（221/428），TT型占5.37%（23/428）。2組間基因型及等位基因頻率分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 2組ABCA1基因-14 bp位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布

2.4 ABCA1基因-14 bp位點(diǎn)不同基因型的血脂比較 對(duì)照組中T等位基因攜帶者血清中HDL-C水平明顯低于非攜帶者（P<0.05），而血清中TC、TG和LDL-C水平在2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表4。

表4 對(duì)照組中不同ABCA1基因-14 bp位點(diǎn)基因型的血脂比較 （mmol/L±s）

表4 對(duì)照組中不同ABCA1基因-14 bp位點(diǎn)基因型的血脂比較 （mmol/L±s）

*P<0.05

基因型CC CT/TT t n 83 117 TC 5.06±0.43 5.19±0.34 0.246 TG 1.23±0.32 1.27±0.49 0.568 HDL-C 1.17±0.19 0.86±0.23 3.416*LDL-C 2.01±0.32 2.08±0.15 0.357

3 討論

ABCA1是一種重要的膽固醇流出調(diào)節(jié)蛋白，能介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，使之與載脂蛋白A（ApoA）-Ⅰ結(jié)合并包裝形成HDL的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。因此，ABCA1是調(diào)節(jié)血漿HDL及細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平的重要膜蛋白，ABCAl的表達(dá)水平與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生關(guān)系密切[3]。

多種代謝酶和載脂蛋白的活性以及脂蛋白顆粒的大小改變皆與ABCA1基因突變相關(guān)，引起膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)異常[4]。ABCA1基因變異最常見方式是單核苷酸多態(tài)性（SNPs），研究熱點(diǎn)為R219K、R1587K、M883I等位點(diǎn)[5]。Tangier病即ABCAl基因突變所致[6]，該基因突變引發(fā)膽固醇流出障礙，血漿中ApoA-Ⅰ不能從外周細(xì)胞獲得膽固醇并包裝形成HDL，從而被迅速降解，繼之出現(xiàn)了急性冠脈綜合征（AS）和低HDL血癥等一系列病理改變，提示ABCAl基因突變可導(dǎo)致冠心病的發(fā)生。

最近研究表明，ABCA1基因-14 bp位點(diǎn)C→T基因多態(tài)性與缺血性腦卒中發(fā)生相關(guān)[7]，但其與冠心病易患性研究較少。本研究針對(duì)天津地區(qū)漢族人群進(jìn)行小樣本研究，探討ABCA1基因啟動(dòng)子-14 bp位點(diǎn)C→T基因多態(tài)性與冠心病發(fā)生及血脂的關(guān)系。冠心病組與對(duì)照組中CC、CT、TT這3種基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于冠心病組患者血脂水平多受降脂藥物影響，且服藥不規(guī)律，難以評(píng)價(jià)其血脂水平與基因型之間的相關(guān)性，故僅在對(duì)照組（未服用任何降脂藥物）中進(jìn)行基因型和血脂水平的分析。結(jié)果顯示，對(duì)照組中T等位基因攜帶者血清中HDL-C水平明顯低于非攜帶者，但T等位基因在冠心病組和對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)果提示ABCA1基因啟動(dòng)子-14 bp位點(diǎn)C→T突變導(dǎo)致HDL-C降低，但并不能證明其可導(dǎo)致冠心病的發(fā)生。本研究標(biāo)本數(shù)量過(guò)少，且冠心病為多種危險(xiǎn)因素協(xié)同作用。因此，仍需較大樣本進(jìn)行分子生物學(xué)試驗(yàn)研究以進(jìn)一步闡明兩者間的內(nèi)在聯(lián)系。

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