鐘 麒 高玉霞 常 紅 王 璇 張美琳 邊姍姍 黃國偉

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是以體內(nèi)嘌呤代謝紊亂、尿酸增高為特征的疾病。目前其在中老年男性中的發(fā)病率逐年升高[1]。HUA可誘發(fā)痛風(fēng)、尿石癥等疾病,且血尿酸水平升高與代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）密切相關(guān)[2]。代謝組學(xué)對于了解疾病狀態(tài)時代謝譜的改變及改變的機制，尋找與疾病進展有關(guān)的代謝或代謝產(chǎn)物及其導(dǎo)致疾病進展的機制有重要價值[3]。本研究通過對HUA患者血漿代謝物的檢測，為探討HUA病因、HUA與其他MS組分的關(guān)系提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2009年12月—2010年1月和平區(qū)事業(yè)單位工作人員10例，均為男性，其中健康對照組5例，平均年齡（49.40±3.96）歲；單純HUA組5例，平均年齡（50.56±5.19）歲。2組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.33，P>0.05）。HUA患者血尿酸≥420 μmol/L，且不患有高血壓、高血脂、糖尿病等其他慢性非傳染性疾病[4]。

1.2 儀器與試劑 INOVA 600 MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀，配備脈沖場梯度，帶梯度場的三共振探頭（美國瓦里安公司）；離心機（德國Eppendorf公司）；重水（D2O，99.9%，美國Cam?bridge Isotope Laboratories,Inc公司）；3-三甲基硅烷基-2，2，3，3-四氘代丙酸鈉（TSP，德國Merck公司）。

1.3 樣品采集和配制 清晨空腹取靜脈血5 mL，對樣品以3 000 r/min離心10 min，取上清液（血漿）300 μL，-80℃冷凍保存。進行氫核磁共振（1H-NMR）實驗前，對樣品進行室溫下解凍，再向編號后的離心管中分別依次加入100 μL TSP的重水溶液（1 g/L），300 μL血清以及200 μL D2O。溶液充分震蕩混勻后，14 000 r/min離心10 min，取550 μL上清加入5 mm核磁共振管中待用。

1.4 NMR實驗 對每個血漿樣本分別采用弛豫編輯脈沖譜（CPMG脈沖譜）（-RD-90°-（τ-180°-τ）n-ACQ）和擴散編輯脈沖譜（LEDbpp脈沖譜）（-RD-90°-G1-180°-G1-90°-T-90°-G1-180°-G1-90°-τ-90°-ACQ）采集血漿樣本的數(shù)據(jù)，分別觀測血漿中的小分子代謝物和脂類代謝產(chǎn)物。CPMG實驗的譜寬為8 000 Hz，采樣點數(shù)64 k，采樣時間4 s，累加次數(shù)64次，τ為200 ms，2 nτ為320 ms，弛豫延遲為2 s，其間采用低功率脈沖對水峰進行預(yù)飽和。LEDbpp實驗的譜寬為8 000 Hz，采樣點數(shù)64 k，采樣時間4 s，累加次數(shù)64次，擴散時間為100 ms，τ為5 ms，弛豫延遲為2 s，其間采用低功率脈沖對水峰進行預(yù)飽和。在對自由感應(yīng)衰減（free induction decay，F(xiàn)ID）信號數(shù)據(jù)進行填零，分別加上1 Hz（CPMG實驗）和3 Hz（LEDbpp實驗）的線增寬因子后進行傅立葉變換轉(zhuǎn)得到1H-NMR譜圖。以乳酸甲基信號雙峰的左側(cè)峰定標(biāo)為δ1.33。

1.5 NMR數(shù)據(jù)處理 對所得NMR數(shù)據(jù)經(jīng)傅立葉變換得到譜圖，調(diào)整相位并進行基線校正。對CPMG數(shù)據(jù)，將0.4～4.4范圍內(nèi)的譜按照每段0.04 Pulse Position Modulation（ppm，一種脈沖位置根據(jù)被調(diào)信號的變化而變化的調(diào)制方法）。進行分段積分；對LED數(shù)據(jù)，將0～6.0范圍內(nèi)的譜按照每段0.04 ppm進行分段積分，并將4.6～5.0之間的譜排除。將積分按每張譜的總積分強度歸一化。所得數(shù)據(jù)輸出并轉(zhuǎn)換到Excel文件保存。

1.6 數(shù)據(jù)分析 將保存的Excel格式數(shù)據(jù)輸入到SIMCA-P+軟件（v10.04，Umetrics，Umea，Sweden）進行多元統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用平均中心化（mean centering）或Pareto標(biāo)度化（Pare?to scaling）進行預(yù)處理之后行主成份分析（PCA）。對于因受各種因素影響而導(dǎo)致組內(nèi)個體差異特別大的情況，采用正交信號校正（orthogonal signal correction，OSC）處理后進行偏最小二乘法（PLS）分析。分析結(jié)果以得分圖（scores plot）和載荷圖（loadings plot）的形式表示。

2 結(jié)果

2.11H-NMR圖譜模式變化圖 得分圖顯示組間代謝模式具有差別，見圖1A、B；載荷圖示導(dǎo)致上述差別的具體代謝物為極低密度脂蛋白（VLDL，δ0.9、1.3）、乳酸（Lac，δ1.34）、乙醇（Ethanol，δ1.18、3.66）、飽和脂肪酸（SFA，δ1.58、2.22）、N-乙酰糖蛋白（Nac，δ2.06）、谷氨酰胺（Gln，δ2.42、2.46）、卵磷脂（PC，δ3.22）、葡萄糖（glucose，δ3～4），見圖1 C、D。

2.2 代謝物變化分析 核磁共振譜圖示HUA組較健康對照組的血漿代謝物中SFA、Nac、VLDL、Lac、Ethanol的水平上升，PC、glucose、Gln的水平較健康對照組下降，見圖2、3。

3 討論

1H-NMR代謝組學(xué)法是通過分析核磁共振譜圖上不同化學(xué)位移處的色譜信號，推斷相應(yīng)代謝物水平的高低，從而得到體內(nèi)代謝組（metabolome）即生物樣本、系統(tǒng)、組織或細胞中小分子化合物的總體信息的過程。

由于女性體內(nèi)雌激素能夠促進尿酸排泄，不同性別的HUA患病率不同；吸煙、飲酒、膳食等不同的生活方式對代謝組學(xué)的結(jié)果均有影響。本組選取有吸煙、飲酒嗜好的男性為研究對象，研究對象早、午均在單位就餐，HUA組生活方式盡可能一致，以均衡生活方式因素對于代謝組學(xué)結(jié)果的影響。

本研究中對1H-NMR CPMG譜的主成分分析結(jié)果顯示，HUA組較健康對照組血漿中Nac、Lac、Ethanol的水平上升；PC、Gln、glucose的濃度降低，表明2組血漿代謝物的組成成分能夠明顯區(qū)分兩者。對1H-NMR LED譜的主成分分析結(jié)果示，從脂類代謝產(chǎn)物上區(qū)分了HUA組和健康對照組，表現(xiàn)為HUA組較健康對照組SFA、Nac、VLDL的水平上升；PC的水平下降。

有研究認為血漿中的SFA濃度、VLDL的水平與心血管疾病的發(fā)病危險性成正比，而PC則是心血管疾病的保護性因素，且大量流行病學(xué)證據(jù)和臨床研究均證實了HUA是心血管事件的獨立危險因素[5]。本研究結(jié)果提示HUA組與心血管疾病發(fā)生了相同的脂類代謝改變，這從分子水平反映了HUA與心血管疾病的聯(lián)系。Lac是糖酵解過程正常代謝產(chǎn)物，Lac水平的上升，提示糖酵解加劇，由glucose無氧酵解生成的Lac增多。2型糖尿病常有輕微的高乳酸血癥，這可能與Lac的氧化缺陷有關(guān)[6]。HUA患者血漿中乳酸水平升高，可能是因為與2型糖尿病有共同的發(fā)病機制，也可能是由于病程中具有共同的病生理改變，尚有待進一步研究確認。

綜上，HUA患者存在脂類代謝異常、糖酵解加劇等問題，這些代謝物的改變可能與HUA的發(fā)病、病程轉(zhuǎn)歸有關(guān)，也可能為HUA與MS各組分的關(guān)系研究提供線索與依據(jù)。

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