董偉偉，譚 建，王 澎，李 瑋

（天津醫(yī)科大學總醫(yī)院核醫(yī)學科，天津300052）

端粒酶是一種核糖核蛋白體，由RNA與蛋白質構成的復合體，是一種特殊的反轉錄RNA依賴性DNA聚合酶[1]。而端粒酶逆轉錄酶(hTERT)是其催化亞單位，是端粒酶激活的限速因素。現(xiàn)在研究證實，hTERT啟動子可以接到很多治療基因的表達，比如caspase-8、bax、白喉毒素A、胸苷激酶、rev-caspase-6、FADD和TRAIL，細胞毒性作用被限制在端粒酶表達陽性的腫瘤細胞系內。所以，hTERT啟動子在腫瘤的靶向性治療中是一個很有希望的腫瘤特異性啟動子[2-3]。鈉碘轉運體基因（NIS）是一個膜內糖蛋白，它將碘轉運入甲狀腺濾泡細胞內是Na+/K+ATP依賴性[4]。轉染NIS后非甲狀腺來源的惡性腫瘤可以攝取碘，這一點在如前列腺癌、結腸癌[5]、乳腺癌、肝癌[6]、肺癌[7]等腫瘤中得到證實。但是NIS基因介導的基因治療依然存在著很多問題,例如在非甲狀腺細胞中表達NIS基因雖然能引起快速的碘內流，但是也伴隨著快速的碘外流，這就限制了其對腫瘤細胞的殺傷作用[8]。Nakamoto等[9]研究發(fā)現(xiàn)NIS基因和TPO基因的共轉染不僅能提供細胞攝碘率,還能延長碘在細胞內的滯留時間。所以，筆者計劃利用hTERT啟動子具有腫瘤靶向性表達特點，以及NIS及TPO基因共轉染可以保證在放射性碘元素聚集在腫瘤組織內并延長碘的潴留時間的特點，構建相應的重組腺病毒。

1 材料和方法

1.1 材料 人膠質瘤細胞系U251由天津醫(yī)科大學總醫(yī)院神經外科實驗室提供，人膠質瘤細胞系U87為本實驗室自己保存，DMEM高糖型及低糖型培養(yǎng)基和lipofectamine TM 2000及TRIzol購自美國Invitrogen公司，實驗所用酶類購自日本TaKaRa公司，熒光分析系統(tǒng)購自美國Promage公司；Western blot分析所用EPS 2A200 electrophoresis系統(tǒng)購自美國Amersham Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 實時定量PCR分析hTERT基因的表達 總RNA使用TRIzol從細胞中提取，然后使用Prime－Script RT-PCR Kit試劑盒反轉錄成cDNA。RT-PCR在96孔板中進行，使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒按照說明書進行。所有的PCR在Stepone plus RT PCR system(美國,ABI公司)中進行，采用的是ΔCT方法統(tǒng)計并以β-actin RNA為對照組。hTERT基因的引物：上游為 5′-CCACCTTGACAAAGTACAG-3′，下游為 5′-CGTCCAGACTCCGCTTCAT-3′。β-actin基因的引物：上游為5′-TCATGAAGTGTGACGTGGAC-3′，下游為 5′-ACCGACTGCTGTCACCTTCA-3′。

1.2.2 hTERT啟動子的克隆 hTERT啟動子區(qū)域采用PCR的方法使用LA-Taq從人類全基因組中提取。hTERT啟動子在5′和3′分別添加BglⅡ和HindⅢ限制性內切酶位點。hTERT啟動子204是截取-204~+56(GenBank AF015950)的區(qū)域，包含核心啟動子和兩個E-boxes。hTERT啟動子378是截取-378～+78的區(qū)域。hTERT啟動子1375是截取-1375~+78區(qū)域，包含全長啟動子序列。PCR條件為：1cycle：94℃2min；30cycles：94℃30s，55℃30s，70℃1 min；1 cycle:72℃10 min and hold 4℃。PCR產物克隆入pMD-18T載體(日本，Takara)，再被BglⅡ和HindⅢ內切酶消化。然后與同樣被BglⅡ和HindⅢ內切酶消化的pGL3-Basic vector載體相連接，被命名為pGL3-hTERT 204,pGL3-hTERT 378和pGL3-hTERT 1375。

1.2.3 熒光分析 不同長度的hTERT啟動子在腫瘤細胞中表達的熒光表達實驗由Dual-Glo Luciferase assay system(美國,Promage公司)檢測。將細胞移植在24孔板中，使用lipefection 2000將pGL3-hTERT 204,pGL3-hTERT 378，pGL3-hTERT 1375和pRL-TK，對照組質粒pGl3-control（攜帶SV40啟動子）轉染，37℃孵育6 h。轉染后細胞繼續(xù)孵育24 h，測定熒光量。

1.2.4 重組腺病毒的構建 NIS基因（上游：5′-CCATGGATGGAGGCCGTGGAG-3′,下游：5′-TCTAGACTCCTGCTGGTCTCG-3′） 是從全長 NIS cDNA文庫中被克隆出來，并在上下游添加NcoⅠ和XbaⅠ酶切位點，然后與NcoⅠ和XbaⅠ消化后的pGL3-hTERT質粒相連接，并命名為pGL3-hTERT-NIS質粒，這個質粒包含從-204到+56的hTERT啟動子片段和NIS基因。攜帶在hTERT啟動子引導下NIS基因的片段被從pGL3-hTERT-NIS質粒中克隆出來，并在上下游添加Xho 1和sal 1酶切位點，然后插入pShuttle中間質粒。NIS基因添加Xho 1和sal 1酶切位點并插入pShuttle-CMV中間質粒。AdhTERT-NIS，Ad-CMV-NIS ，Ad-CMV-TPO 及 Ad-CMV-EFGP重組質粒使用 AdEasyTMAdenoviral Vector System構建成功并在-80℃保存。

1.2.5 重組腺病毒轉染U251及U87細胞系及MRC-5細胞 實際分為Ad-hTERT-NIS轉染組、陽性對照Ad-CMV-NIS轉染組、陰性對照Ad-CMV-EFGR轉染組。U251及U87細胞在6空板中培養(yǎng)到5×105~1×106個細胞每孔時準備轉染。AdhTERT-NIS、Ad-CMV-NIS、Ad-CMV-EFGR 重組病毒轉染是按50 MOI進行轉染并孵育6 h，然后更換新的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。進行轉染后，細胞繼續(xù)在新培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h并準備實驗。重組腺病毒Ad-CMV-TPO的轉染同上。

1.2.6 Western blot分析 使用 EPS 2A200 electrophoresis系統(tǒng)進行western blot分析。提取細胞總蛋白，然后SDS-PAGE10%凝膠電泳，使用80 V進膠，140 V電泳至溴酚藍距下緣1 cm處終止。轉PVDF膜，5%脫脂牛奶4℃封閉過夜。NIS基因一抗選用1∶200的羊NIS多克隆抗體 (美國，sc-48055，Santacruz)，室溫下孵育2h。NIS基因二抗選用1∶2000的羊抗兔抗體(美國，sc-2004，Santa cruz)，室溫下孵育2 h。TBST洗4次，每次5 min。然后加入ECL化學發(fā)光反應液（美國，Thermo公司），室溫1 min。使用富士相紙暗室曝光1~3 min。

2 結果

2.1 hTERT基因在 U251，U87和MRC-5中的表達 RT-PCR實驗中證明hTERT mRNA能在端粒酶陽性的腫瘤U251、U87細胞中表達，在端粒酶陰性的正常細胞MRC-5細胞無表達，見圖1。Realtime-PCR分析實驗證明，hTERT mRNA在U251和U87細胞中表達程度相似，但是U87細胞的表達水平稍高于U251細胞，見表1。

2.2 熒光表達分析 瞬時轉染實驗證明，在端粒酶陽性的U251和U87細胞中hTERT啟動子可以引導熒光基因的表達，而在端粒酶陰性的MRC-5細胞中不能表達。但是，hTERT啟動子204,378,1375擁有不同的啟動效率，hTERT啟動子204啟動效果最好，其相對表達活性在U87和U251中能達到公認強啟動子SV40啟動子的50%。見圖2。

圖1 hTERT mRNA在U251、U87及MRC-5細胞中RT-PCR電泳圖Fig 1 RT-PCR electrophoresis of hTERT mRNA in cells of U251,U87 and MRC-5

表1 U251和U87細胞系hTERT基因及β-acting基因的相對mRNA表達水平Tab 1 Relative mRNA expression levels of hTERT gene and βacting gene in U251 and U87 cell lines

圖2 U251和U87細胞中hTERT啟動子熒光表達分析Fig 2 Luciferase activity of hTERT promoter in human malignant gloma cell line U251 and U87

2.3 重組腺病毒Ad-hTERT-NIS及Ad-CMV-TPO轉染后western blot分析 在U87和U251細胞系中，NIS蛋白在70kDa有表達帶，TPO基因在110kDa有表達帶，但是NIS蛋白表達量相對對照組蛋白表達量較低。見圖3。

圖3 NIS表達水平的western blot分析Fig 3 Western blot analysis for human sodium/iodide symporter(hNIS)levels

3 討論

特異性啟動子介導目的基因表達的這種基因治療方式可以實現(xiàn)腫瘤的靶向性治療，該治療能在保證最大的組織特異性毒性的同時最大程度地減少對正常組織的損傷。用hTERT啟動子作為基因轉錄調控元件的腫瘤靶向性基因治療是近年來腫瘤研究的熱點之一，大量研究顯示hTERT啟動子在多種惡性腫瘤細胞中有轉錄活性，并被成功應用于凋亡相關基因Caspase-6、自殺基因HSV-TK等不同抗癌基因的腫瘤特異性表達載體的構建,用于肺癌、肝癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤靶向性基因治療的研究[10-11]。應用像hTERT啟動子類似的腫瘤特異性啟動子，為實現(xiàn)腫瘤選擇性基因治療表達提供了有效的途徑。hTERT啟動子介導的NIS基因轉染腫瘤細胞然后進行放射性碘治療，已經進行了很多研究，比如：Anne等[12]用逆轉錄病毒介導NIS對宮頸癌細胞放射性碘治療的研究，顯示了Ad-CMV-NIS轉染入腫瘤細胞后能有效地促其攝碘，這使得一種嶄新的癌基因靶向性治療成為可能。Shi等[13]用腺病毒介導的hTERT-NIS對肺癌殺傷力的研究，顯示由腺病毒介導hTERT啟動子啟動的NIS的表達有希望成為一種有效、廣譜而又非常特殊的抗癌策略，Kim等[14]用hTERT-NIS轉染入肝癌細胞后行放射性核素顯像和治療，表明腫瘤細胞轉染hTERT-NIS后攝碘能力是未轉染的22倍。hTERT啟動子序列能有效地引導其轉染基因在腫瘤的靶向性表達，然后NIS基因介導放射性碘治療殺傷腫瘤細胞。

為了研究hTERT啟動子引導NIS基因介導放射性碘治療膠質瘤的可能性，筆者構建了一個在hTERT啟動子引導NIS基因表達的重組腺病毒Ad-hTERT-NIS，研究其在膠質瘤細胞系U251和U87細胞中是否有有效的碘攝取。NIS是一個轉運體基因，在甲狀腺細胞中能主動攝取碘。在甲狀腺中NIS介導的碘濃集是其顯像的基礎，同時也是分化甲狀腺癌及其轉移灶放射性碘治療的基礎。NIS③已經在1996年從人類甲狀腺基因文庫中克隆出來。在腫瘤細胞中目標性表達功能性NIS基因能使這些細胞濃集碘并提供了放射性碘治療的可能性。很多研究者已經發(fā)現(xiàn)轉染NIS基因到腫瘤細胞后比較非轉染細胞能增加放射碘的攝取。但是研究者同時也發(fā)現(xiàn)轉染NIS基因后的腫瘤細胞中當介質中的放射性碘被移走后，細胞存在快速的碘流失現(xiàn)象。后來，研究者們發(fā)現(xiàn)共轉染NIS和hTPO基因能增加放射性的碘攝取和潴留并增加腫瘤細胞的殺傷率。因此本實驗還構建了Ad-CMV TPO重組病毒，為在后續(xù)實驗中驗證NIS和TPO的共轉染是否能增加碘的攝取和潴留打下基礎。

在本研究中，筆者經過PCR技術擴增hTERT目的片段，通過細胞瞬時轉染熒光表達實驗，發(fā)現(xiàn)hTERT啟動子204較其他片段的啟動效率要高，然后，建立重組腺病毒Ad-hTERT-NIS轉染組、陽性對照Ad-CMV-NIS轉染組、陰性對照Ad-CMV-EFGR轉染組及Ad-CMV-TPO分別轉染U251及U87細胞系及MRC-5細胞，通過NIS基因的蛋白質western blot分析發(fā)現(xiàn)，U87和U251細胞中有NIS蛋白的表達，即hTERT啟動子可以引導NIS基因的表達，在端粒酶陽性的膠質瘤細胞中可以引導NIS基因的表達，而在端粒酶陰性的MRC-5細胞中則不能表達NIS基因；說明重組腺病毒Ad-hTERTNIS構建成功。

綜上所述，hTERT啟動子引導NIS基因確實能實現(xiàn)在端粒酶陽性細胞中特異性表達的目的，能實現(xiàn)有效的腫瘤組織特異性。NIS不僅在甲狀腺對碘的主動轉運過程中發(fā)揮關鍵作用,而且在多種甲狀腺疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演十分重要的角色，對NIS進行深入研究，無疑具有誘人的臨床應用前景。hTERT啟動子引導NIS基因對神經膠質瘤的治療還期待進一步提高，有學者研究131I-IPA結合外部射線放射性治療能提高膠質瘤的治療效果[15]，筆者期待更好的治療膠質瘤方法出現(xiàn)。

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